RhoA/ROCK信号通路在青霉素和双黄连注射液类过敏反应中的作用研究

摘要

目的
　　研究两种代表性注射剂青霉素注射液和双黄连注射液的过敏样反应特点，探讨其导致血管内皮通透性增加的机理，阐明RhoA/ROCK信号通路在青霉素和双黄连注射液致类过敏反应中所起到的作用。此外，明确双黄连注射液导致类过敏反应的主要成分。
　　方法
　　1、青霉素注射液过敏样反应特点
　　(1) ICR小鼠腹腔注射6.25、25或100万单位·kg-1青霉素钠（氢氧化铝为佐剂）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏小鼠和未致敏小鼠分别一次性尾静脉注射3.125、12.5或50万单位·kg-1青霉素钠和伊文思蓝(EB)的混合液。给药30min后，以小鼠耳廓蓝染面积评分和耳组织EB渗出量为指标，分别观察青霉素注射液引起小鼠过敏反应和类过敏反应的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射青霉素钠致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。将血清注射到空白小鼠背部皮肤使其被动致敏，2h后对小鼠一次性尾静脉注射3.125、12.5或50万单位·kg-1青霉素钠和EB的混合液。30min后，观察接受血清小鼠皮肤内侧蓝斑情况。
　　(3) ICR小鼠一次性尾静脉注射12.5、25或50万单位·kg-1青霉素钠，给药30min后处死动物，用打耳器打下耳片称重，同时取耳和肺组织进行病理学检查。
　　2、双黄连注射液过敏样反应特点
　　(1) ICR小鼠腹腔注射300mg·kg-1双黄连（氢氧化铝为佐剂）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏小鼠一次性尾静脉注射600mg·kg-1双黄连和EB的混合液。给药30min后，以小鼠耳廓蓝染面积评分和耳组织EB渗出量为指标，分别观察双黄连注射液引起小鼠过敏反应和类过敏反应的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射双黄连注射液致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。将血清注射到空白小鼠背部皮肤使其被动致敏，2h后对小鼠一次性尾静脉注射600mg·kg-1双黄连和EB的混合液。给药30min后，观察接受血清小鼠皮肤内侧蓝斑情况。
　　(3) ICR小鼠一次性尾静脉注射150、300或600mg·kg-1双黄连和EB的混合液，给药30min后对小鼠耳廓蓝染面积进行评分，用打耳器打下耳片称重，定量测定耳组织EB渗出量，并取耳、肺、肠组织进行病理学检查。
　　3、青霉素注射液类过敏反应的产生机制
　　(1)对血管内皮细胞单层通透性的影响:采用Transwell小室将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养成体外血管内皮细胞单层，加入0.125、0.5或2万单位·mL-1青霉素注射液与血管内皮细胞单层孵育1h后，检测FITC-葡聚糖透过细胞单层的情况。
　　(2)对血管内皮细胞骨架的影响:采用细胞培养板培养HUVECs，加入0.125、0.5或2万单位·mL-1青霉素注射液孵育1h，用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞F-actin染色，观察细胞骨架的变化。
　　(3)对RhoA/ROCK信号通路的影响:采用培养皿培养HUVECs，加入0.5万单位·mL-1青霉素注射液孵育5、15、30、60min，收集细胞。采用Western-blot方法检测细胞GTP-RhoA（GTP-RhoA/RhoA％）、p-MYPT1(p-MYPT1/MYPT1％)和p-MLC2(p-MLC2/MLC2％)蛋白的表达。另外，小鼠一次性尾静脉注射50万单位·kg-1青霉素钠，给药15、30、60、120min后取耳和肺组织，采用Western-blot方法检测组织中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表达。
　　(4) ROCK抑制剂对青霉素注射液作用的影响:在培养的HUVECs或细胞单层中加入盐酸法舒地尔预先处理后，加入青霉素注射液，按照上述同样方法检测p-MYPT1和p-MLC2表达变化、血管内皮细胞骨架变化以及细胞单层FITC-葡聚糖透过情况。此外，小鼠腹腔注射给予法舒地尔3次后，经尾静脉注射50万单位·kg-1青霉素钠，给药后15min和30min分别取耳和肺组织检测p-MYPT1和p-MLC2表达变化情况。小鼠腹腔注射给予法舒地尔3次后，经尾静脉注射50万单位·kg-1青霉素钠和EB的混合液，30min后进行耳廓蓝染面积、耳组织EB渗出量、耳片重量、耳和肺组织病理学等检查。
　　4、双黄连注射液类过敏反应的产生机制
　　(1)对血管内皮细胞单层通透性的影响:采用Transwell小室培养体外血管内皮细胞单层，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1双黄连注射液与血管内皮细胞单层孵育1h后，检测FITC-葡聚糖透过细胞单层的情况。
　　(2)对血管内皮细胞骨架的影响:采用细胞培养板培养HUVECs，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1双黄连注射液孵育1h，用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞F-actin染色，观察细胞骨架的变化。
　　(3)对RhoA/ROCK信号通路的影响:采用培养皿培养HUVECs，加入0.15mg·mL-1双黄连注射液孵育15、30、60、120min，收集细胞。采用Western-blot方法检测细胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表达。另外，小鼠一次性尾静脉注射600mg·kg-1双黄连注射液，给药15、30、60、120min后取耳、肺和肠组织，采用Westem-blot方法检测组织中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表达。
　　(4) ROCK抑制剂对双黄连注射液作用的影响:在培养的HUVECs或细胞单层中加入盐酸法舒地尔预先处理后，加入双黄连注射液，按照上述同样方法检测p-MYPT1和p-MLC2表达变化、血管内皮细胞骨架变化、以及细胞单层FITC-葡聚糖透过情况。此外，小鼠腹腔注射给予法舒地尔3次后，经尾静脉注射600mg·kg-1双黄连，给药后30min分别取耳、肺和肠组织检测p-MYPT1和p-MLC2表达变化情况。小鼠腹腔注射给予法舒地尔3次后，经尾静脉注射600mg·kg-1双黄连和EB的混合液，30min后进行耳廓蓝染面积、耳组织EB渗出量、耳片重量、耳、肺和肠组织病理学等检查。
　　5连翘酯苷类成分的类过敏反应及其致类过敏机制研究
　　(1)类过敏反应研究:采用Transwell小室培养体外血管内皮细胞单层，分别加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1连翘酯苷A、B或E孵育1h后，检测FITC-葡聚糖透过细胞单层的情况。采用细胞培养板培养HUVECs，加入上述浓度的连翘酯苷A、B或E孵育1h，用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞F-actin染色，观察其对血管内皮细胞骨架的影响。另外，小鼠一次性尾静脉注射600mg·kg-1连翘酯苷A、B或E，给药30min后观察耳廓蓝染面积，定量测定耳组织EB渗出量，以评价体内类过敏反应。
　　(2)类过敏机制研究:采用培养皿培养HUVECs，加入0.05、0.1或0.15 mg·mL-1连翘酯苷A、B或E，收集细胞。采用Western-blot方法检测细胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表达。在培养的HUVECs或细胞单层中加入盐酸法舒地尔预先处理后，加入连翘酯苷A或B，按照上述同样方法检测p-MYPT1和p-MLC2表达变化、血管内皮细胞骨架变化、以及细胞单层FITC-葡聚糖透过情况。
　　结果
　　1、青霉素注射液致小鼠类过敏反应
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在静脉注射给予青霉素钠后，均出现类似的耳蓝染反应，这种反应与青霉素剂量成正相关，与致敏无关。PCA试验显示青霉素注射液不能诱导IgE产生，因此青霉素注射液诱导的上述反应不是IgE介导的，可能是类过敏反应。组织病理学检查发现，青霉素钠单次静脉注射后，小鼠的耳和肺组织出现剂量相关的水肿和炎症反应，提示青霉素注射液可导致小鼠产生以血管渗出增加和炎症反应为特征的类过敏反应。
　　2、双黄连注射液致小鼠类过敏反应
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在静脉注射给予双黄连后，均出现类似的耳蓝染反应，这种反应与致敏无关。PCA试验显示双黄连注射液不能诱导IgE产生，因此双黄连注射液诱导的上述反应不是IgE介导的，可能是类过敏反应。此外，双黄连注射液所导致的耳蓝染反应与给药剂量正相关。组织病理学检查发现，双黄连单次静脉注射后，小鼠的耳、肺和肠组织出现剂量相关的水肿和炎症反应。结果提示，双黄连注射液可导致小鼠产生以血管渗出增加和炎症反应为特征的类过敏反应。
　　3、RhoA/ROCK信号通路参与青霉素注射液的类过敏反应
　　在体外试验中，0.5或2万单位·mL-1青霉素注射液可导致HUVECs肌动蛋白明显聚集和重组以及血管内皮细胞单层通透性显著增加，反应与浓度相关。0.5万单位·mL-1青霉素注射液可导致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2表达增加，以加药后15-30min作用最为明显，之后出现下降的趋势。采用法舒地尔预处理可以明显改善青霉素注射液诱导的血管内皮细胞单层通透性增加和细胞骨架变化。在体内试验中，小鼠一次性尾静脉注射给予50万单位·kg-1青霉素钠会导致耳和肺组织GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表达增加，蛋白上调一般在给药后15-30min最为明显，之后出现下降的趋势。预先给予法舒地尔可以抑制青霉素注射液所引发的血管渗出增加和炎症反应。结果提示，RhoA/ROCK信号通路激活是诱导青霉素注射液类过敏反应的重要机制之一。
　　4、RhoA/ROCK信号通路参与双黄连注射液的类过敏反应
　　在体外试验中，0.1或0.15mg·mL-1双黄连注射液可导致HUVECs肌动蛋白聚集和重组以及血管内皮细胞单层通透性增加，反应与浓度有一定相关性。0.15mg·mL-1双黄连注射液可导致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表达增加，以加药后15-30 min作用最为明显，之后出现下降的趋势。采用法舒地尔预处理可以改善双黄连注射液诱导的血管内皮细胞单层通透性增加和细胞骨架变化。在体内试验中，小鼠一次性尾静脉注射给予600mg·kg-1双黄连会导致耳、肺、肠组织GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表达增加，蛋白上调一般在给药后15-60min最为明显，之后出现下降的趋势。预先给予法舒地尔可以抑制双黄连注射液所引发的血管渗出增加和炎症反应。结果提示，RhoA/ROCK信号通路激活是诱导双黄连注射液类过敏反应的重要机制之一。
　　5、RhoA/ROCK信号通路参与连翘酯苷的类过敏反应
　　在体外试验中，0.1或0.15mg·mL-1连翘酯苷A和连翘酯苷B可导致HUVECs单层通透性明显增加，而连翘酯苷E对细胞单层通透性影响较小。与通透性结果一致，0.1或0.15mg·mL-1连翘酯苷A和连翘酯苷B可诱导HUVECs细胞骨架变化，而连翘酯苷E的作用相对较弱。连翘酯苷A和连翘酯苷B可导致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表达呈浓度相关性增加，其中连翘酯苷A的作用强于连翘酯苷B，而连翘酯苷E则对蛋白的表达几乎没有影响。给予法舒地尔可以明显抑制连翘酯苷A和连翘酯苷B诱导的血管内皮细胞单层通透性增加和细胞骨架变化。通过体内试验验证发现，连翘酯苷A和连翘酯苷B可引起小鼠血管渗出增加，而连翘酯苷E则未见该作用。结果提示，连翘酯苷通过激活RhoA/ROCK信号通路诱发动物类过敏反应的作用与化合物的化学结构有关。
　　结论
　　1、青霉素和双黄连注射液均可诱发小鼠出现以血管渗出增加和炎症反应为特征的类过敏反应;未诱导IgE介导的过敏反应。二者所致的类过敏反应均具有剂量相关性，提示临床上控制剂量可能降低该不良反应。
　　2、RhoA/ROCK信号通路激活，从而产生血管内皮细胞骨架调整，致使血管通透性增高，是青霉素和双黄连注射液类过敏反应的重要机制之一。
　　3、连翘酯苷类成分是双黄连注射液的主要致类过敏成分之一，但不同的连翘酯苷引起的反应强度差别较大。其中，连翘酯苷A诱发的反应最强，其次为连翘酯苷B，连翘酯苷E未见明显反应。连翘酯苷的类过敏反应也与RhoA/ROCK信号通路激活有关。

目录

声明

摘要

英文缩写语

文献综述

Rho／RoCK信号通路研究进展

参考文献

双黄连注射液不良反应研究进展

参考文献

前言

参考文献

第一部分 青霉素注射液和双黄连注射液的过敏样反应特点

一、青霉素注射液过敏样反应的特点

(一)青霉素注射液过敏样反应的性质

(二)青霉素注射液类过敏反应的组织学研究

(三)讨论

二、双黄连注射液过敏样反应的特点

(一)双黄连注射液过敏祥反应的性质

(二)双黄连注射液类过敏反应的组织学研究

(三)讨论

参考文献

第二部分 青霉素注射液和双黄连注射液类过敏反应的产生机制

一、青霉素注射液类过敏反应的产生机制

(一)青霉素注射液细胞毒性试验

(二)青霉素注射液对血管内皮细胞单层通透性的影响

(三)青霉素注射液对血管内皮细胞骨架的影响

(四)青霉素注射液对血管内皮细胞RhoA／ROCK信号通路的影响

(五)ROCK抑制剂对青霉素注射液诱导的血管内皮细胞变化的影响

(六)青霉素注射液对小鼠RhoA／ROCK信号通路的影响

(七)ROCK抑制剂对青霉素注射液致小鼠类过敏反应的影响

(八)讨论

二、双黄连注射液类过敏反应的产生机制

(一)双黄连注射液细胞毒性试验

(二)双黄连注射液对血管内皮细胞单层通透性的影响

(三)双黄连注射液对血管内皮细胞骨架的影响

(五)ROCK抑制剂对双黄连注射液诱导的血管内皮细胞变化的影响

(六)双黄连注射液对小鼠RhoA／ROCK信号通路的影响

(七)ROCK抑制剂对双黄连注射液致小鼠类过敏反应的影响

(八)讨论

参考文献

第三部分 连翘酯苷致类过敏反应机制

(一)连翘酯苷细胞毒性试验

(二)连翘酯苷对血管内皮细胞单层通透性的影响

(三)连翘酯苷对血管内皮细胞骨架的影响

(四)连翘酯苷对血管内皮细胞RhoA／ROCK信号通路的影响

(五)ROCK抑制剂对连翘醋苷诱导的血管内皮细胞变化的影响

(六)连翘酯苷的类过敏反应研究

(七)讨论

参考文献

第四部分 综合讨论

参考文献

创新点

致谢

攻读博士期间发表文章及著作情况