一个人类α甘露糖苷酶全长cDNA的克隆、序列分析与编码蛋白质性质初探

摘要

机体的蛋白质大多以糖复合物的形式存在，而糖蛋白中的聚糖不但与蛋白质的生物学功能密切相关，而且本身也有着重要的生物学意义，因此成为继蛋白质和核酸之后以一生命科学的重要研究领域。尽管因为聚糖结构十分复杂，使其结构和功能的研究困难重重，但近年来，随着分子生物学和技术的渗入，极大地促进了糖蛋白聚糖结构和功能的研究。α-甘露糖苷酶作为一种重要的糖加工酶，参与N-聚糖的加工成熟。为了研究其在聚糖生物合成中的作用，学者们已先后从母和多种哺乳动物细胞中克隆出了十多个不同的α-甘露糖苷酶的基因。自一个人扁桃体细胞λgt11cDNA文库中筛选到了一个长1358bp的cDNA克隆，内含一个编码425个氨基酸的开放阅读框架。从此框架核苷酸序列推断的氨基酸序列与一个大鼠内质网α-甘露糖苷酶氨基酸序列的后二分之一高度同源。为了确定其是否为全长cDNA，研究人员进行了人多种组织中6A8mRNANorthernblot检测。结果表明6Ai有两个转录本形式，一为±4.3kb，另一为±3.5kb。这表明1358bpcDNA非为全长cDNA。自6A8cDNA编码蛋白质推断的氨基酸序列分析表明，基氨基酸列正如大鼠内质网α-甘露糖苷酶和酵母空泡α-甘露糖苷酶的序列一样，基NH<，2>-端不具有典型的信号序列，但符合真核细胞信号序列的最低要求，在7个疏水性氨基酸残基中，Ser，Thr，Gly或Pro基未超过一个，并且氨基端至少有一个带有正电荷的氨基酸。

目录

缩写索引

前言

材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果

1Northern blot结果

26A8全长cDNA克隆、序列测定

2.1用32P标记的1358bp 6A8 cDNA作探针筛选扁桃体细胞λgt11 cDNA文库

2.2332bp cDNA片段的克隆与序列测定

2.3232bp片段cDNA的克隆与核苷酸序列测定

2.46A8全长cDNA的拼接及序列分析2.4.1全长6A8cDNA的核苷酸序列及ORF分析

2.46A8全长cDNA的拼接及序列分析2.4.26A8全长cDNA核苷酸序列和其编码慢白质的同源性分析

2.46A8全长cDNA的拼接及序列分析2.4.36A8分长cDNA编码蛋白质的分子量和等电点

2.46A8全长cDNA的拼接及序列分析2.4.46A8全长cDNA编码蛋白质二级结构分析

3pRc/CMV-6A8 cDNA正反两种表达质粒的构建

4ConA结合实验

5RT-PCR方法检测6A8 mRNA在不同免疫细胞株中的表达

66A8cDNA片段编码蛋白的原核表达

讨论

小结

参考文献

α-甘露糖苷酶的研究进展

一、α-甘露糖苷酶的分类

二、两类α-甘露糖苷酶的生物学特性

三、α-甘露糖苷酶在糖蛋白N-聚糖合成与代谢中的作用

四、糖蛋白中寡聚糖的生物学意义

五、总结与展望

参考文献

致谢

博士论文工作期间已发表文章