Dok6通过PTB结构域以依赖酪氨酸磷酸化方式与TrkC的NPQY模体结合

摘要

Dok6是p62Dok家族的新成员。p62DOK(downstream of tyrosine kinase/docking protein)蛋白家族是胞内接头蛋白家族，Dok6属于该家族的Dok4/5亚家族。人DOK6 eDNA开放阅读框长993bp，编码331个氨基酸。DOK6蛋白分子量约38.3kDa。Dok6蛋白具有信号蛋白典型的结构特征：N端的PH结构域(8-114氨基酸)，中央的PTB结构域(130—232氨基酸)，以及C端区域(232-330氨基酸)。定量RT-PCR分析显示Dok6主要在脑组织中高表达，尤其是在胎脑表达量最高。 Trk受体家族是对neurotrophin因子具有高亲和力的受体，是细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，该家族包括3个成员：TrkA、TrkB和TrkC。在neurotrophins刺激下，Trk受体通过二聚体化激活自身的酪氨酸激酶活性，活化的受体能够募集多种信号蛋白并将它们磷酸化，从而把信号由胞外转导到胞内。本实验室发现Dok4/5亚家族的Dok5蛋白与TrkB、TrkC受体相互作用，增强TrkB、TrkC受体介导的：MAPK通路的活化水平并延长其活化时间。 由于Dok6与Dok5具有较高的同源性，又都在神经系统高表达，Dok6也存在与Trk受体相互作用的可能。为了证明这个推断，我们利用酵母双杂交系统、pulldown assay和Co-IP首先验证Dok6与。Trk受体的相互作用，实验结果显示Dok6选择性的与Trk受体家族的TrkC受体相互作用，而不与TrkA、B相互作用。为了进一步确证Dok6与TrkC受体的结合位点及方式，本实验将．Dok6 cDNA分段克隆，在酵母双杂交系统中验证了Dok6只有通过其PTB结构域才能与TrkC受体相互作用，PH结构域与C端都不能与TrkC受体结合。TrkC受体的胞内区五个酪氨酸残基及与酪氨酸激酶活性重要相关的赖氨酸残基的突变体，分别与Dok6 PTB结构域进行了酵母双杂交、pulldown assay验证实验。结果显示，与TrkC受体激酶活性相关的赖氨酸Lys<'572>的突变会破坏Dok6和TrkC受体的相互作用，说明Dok6结合TrkC受体需要依赖受体的酪氨酸激酶活性；位于NPQY模体中的Tyr<'516>的突变同样也破坏了Dok6与TrkC受体的相互作用，说明Dok6识别结合于Trk受体的NPQY模体。通过分段实验及突变分析，我们确定了Dok6的PTB结构域通过依赖酪氨酸磷酸化方式与TrkC的NPQY模体结合。

目录

声明

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

参考文献

综述 长程增强效应（LTP）与mTOR信号通路

附 录

致 谢