重组人心肌肌红蛋白基因工程菌的构建及重组蛋白的初步纯化

摘要

肌红蛋白(myoglobin，Mb)是与血红蛋白相似的血红素蛋白质，是横纹肌组织特有的色素蛋白，分子量为17KD。约占肌肉蛋白质总量的0.1％～0.2％，其分子结构和血红蛋白的亚基相似，由1条多肽链和1个血红素分子构成。人的Mb肽链含153个氨基酸，其结构排列与血红蛋白的n链非常相似。 肌红蛋白(Mb)用于心肌损伤检测的生化标志物已近30年。目前仍普遍用作急性心肌梗死(AMI)的早期珍断。AMI时，损伤的心肌细胞释放Mb入血，在症状发生后1～2h，血清Mb即异常升高。4～8h达最高值，72h后恢复至正常。心电图(ECG)是早期诊断AMI的较可靠检查方法。 长期的临床实践证实，如果将Mb与ECG同时应用，可提高AMI早期诊断率。有研究结果表明，胸痛患者同时进行ECG检查和Mb测定，AMI的诊断率可由单用ECG的62％提高到82％。 但是，目前临床上应用的Mb诊断试剂盒多为国外进口，价格昂贵，限制了Mb在临床上早期诊断中的广泛应用。研制成功具有自主知识产权，完全国产化的Mb诊断试剂盒是当前急需。在研究中发现试剂盒的重要组成成分Mb抗原的来源问题严重制约着Mb试剂盒的国产化进程。传统的方法是从心肌组织中采用生化方法提取，但目前人心肌组织的来源极其困难，且质量也难以保证，致使其产率极低，抗原活性也不理想。因此我们利用基因工程技术构建稳定、高效表达人肌红蛋白的基因工程菌，获得高纯度的Mb，为今后开展Mb诊断试剂盒国产化研究奠定坚实的基础。 本研究的目的是构建稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白的基因工程菌株，并初步纯化重组蛋白以达到制备单克隆抗体的要求，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料，促进心肌肌红蛋白诊断标准化的研究。 设计引物时将上下游引物的两端分别插入NdeⅠ内切酶位点和HindⅢ内切酶位点，可使目的基因准确的插入pET21a(+)表达载体，并简化了cDNA克隆阶段的操作。 采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌红蛋白基因，将其插入到pMD18-T simple克隆载体中，转化E.coli DH5α，经酶切和测序对目的基因分析，再插入到pET-21a(+)表达载体中，转化BL21(DE3)，对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普(R)心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。通过硫酸铵沉淀法以及透析法对重组蛋白进行初步纯化，使其可以达到单克隆抗体制备所需的抗原纯度。 克隆了全长的肌红蛋白基因，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的15％，重组蛋白抗原性良好，抗原纯度为80％，达到制备单克隆抗体所需纯度。 综上所述，成功构建稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白的基因工程菌，并初步纯化出目的蛋白。

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综述：双特异性抗体研究进展及肿瘤治疗中的应用

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