一、四型电压门控钾离子通道N端片段Kv4.3N与通道调节亚基KChIP1的蛋白复合物的结构与功能分析;二、苏氨酸磷酸裂解酶SpvC与其底物肽段复合物的结构基础与其酶活机制的研究

摘要

第一部分 四型电压门控钾离子(Kv4)通道的天然辅助β亚基KChIPs与通道形成α亚基在心脏和大脑形成自然状态的Kv4通道复合物。为了阐明KChIPs在通道复合物中的通道门控调节功能。我们在体外表达和组装了KChIP1和Kv4.3N端复合物蛋白，并通过共结晶的方法得到了复合物的晶体结构。复合物形成了一种独特的钳式结构，结构中每个KChIP1同时结合相邻的两个Kv4.3N端蛋白，组成了存在两种结合区域的4:4复合体。其中，KChIPl分子表面的沟状疏水区域通过疏水作用，捕获通道四聚体中的一个Kv4.3分子的N末端的α-螺旋形成第一个功能必须的相互作用区；同时，这个KChIP1分子与相邻的另一个Kv4.3分子的T1结构域的数个残基形成第二个相互作用区，并稳定了T1结构域的四聚体形式。结合生化、分子生物学和电生理学等研究方法，我们证实了KChIPs是通过与Kv4分子形成这种钳式结构来实现调节通道部分电生理特性的功能。 第二部分 沙门氏菌的致病蛋白SpvC属于一种全新的被称为苏氨酸磷酸裂解酶的蛋白酶家族的一员。苏氨酸磷酸裂解酶可以特异性的识别宿主丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活位点的磷酸化苏氨酸和酪氨酸(pTXpY)序列，并不可逆的去除磷酸化苏氨酸的磷酸基团，以阻断宿主细胞免疫信号通过MAPK通路的传递。为了阐明SpvC是如何特异性的识别并灭活宿主的MAPK蛋白，我们解析了SpvC结合底物肽段的复合物的晶体结构。结构显示，SpvC可特异性的识别底物肽段的磷酸化苏氨酸和酪氨酸。SpvC在结合底物后的构象发生改变，使底物肽段的磷酸化苏氨酸被包围在疏水环境中，排斥了溶剂分子的接触。同时SpvC的K136作为亲核试剂可同时进攻磷酸化苏氨酸的α-氢原子和β-碳原子而分别催化消除反应和取代反应。生化实验也证实了消除反应产生的碳碳双键产物和取代反应产生的连接产物。这些实验结果从不同角度解释了SpvC的催化机制。

目录

研究背景(第一部分)

一、 引言

二、 Kv4钾离子通道的研究概况

三、 本课题的研究意义

蛋白的表达与纯化(第一部分)

一、 引言

1. 表达片段的设计思路：

2. 表达标签的选择与组合

3. 表达及纯化实验流程示意图(图1-2-1)：

二、实验材料及仪器

1. 菌株和载体：

2.试剂和工具酶：

3. 仪器与服务：

三、试验方法及流程

1. 基因的亚克隆

2. 蛋白的表达与纯化

四、 实验结果及分析

晶体的生长与结构的解析(第一部分)

一、 Kv4.3N-KChIPl蛋白复合物的晶体生长

1. 蛋白质晶体的概念与性质

2. 蛋白质结晶的原理

3. 蛋白质晶体的培养及优化

4. 复合物晶体的衍射初试及晶体优化

二、Kv4.3N—KChIPI蛋白复合物结构测定与描述

(一) 晶体衍射的原理

(二) 晶体衍射及结构解析中的方法和应用

(三) 结构模型的建立和修正

(四) 实验过程

三、结构描述

1. 复合物的整体结构

2. Kv4.3N分子与KChIPl分子结合区域的结构

复合物的结构与功能(第一部分)

一、 引言

二、 实验思路

1. 突变的设计思路

2. 对Kv4.3的KBD结构域与KChIPI结合区的突变

3. 对Kv4.3的T1结构域与KChIPl结合区的突变

三、实验方法与原理

1. 定点突变法

2. 检测蛋白间相互作用

四、实验结果与分析

1. 对Kv4.3的KBD结构域的突变

2. 对KChIP1疏水沟的突变

3. KChIP1稳定了Kv4.3N的四聚体结构

4. 电生理学角度验证KChIP1与Kv4.3结合位点的功能

五、 总结

参考文献(第一部分)

研究背景(第二部分)

一、宿主的免疫应答与病原微生物的逃逸

二、 宿主免疫信号的主要分子通路

三、病原体对免疫信号的干扰与苏氨酸磷酸裂解酶的发现

四、本课题的研究意义

蛋白的表达纯化与晶体的生长(第二部分)

一、 引言

1. 底物的选择与共结晶策略

2. 表达策略与表达标签的选择

二、基因的亚克隆与蛋白的表达纯化和分析

1. 基因的亚克隆

2. 蛋白的表达纯化

三、蛋白的结晶

结构的解析与分析(第二部分)

一、数据的收集与结构的解析

1. 数据的收集处理

2. 相位的确定和模型的构建和修正

3. 结构模型参数

二、结构描述与分析

1. Spvc与底物肽段的整体结构

2. Spvc对底物肽段的识别特异性

3. Spvc在结合底物时活性中心的构象变化

磷酸苏氨酸裂解酶的酶活机制的研究(第二部分)

一、 引言

二、 实验方法

1. 蛋白的定点突变

2. SpvC酶活分析

三、实验结果及分析

1. 活性中心的结构与机制分析

2. 突变及生化分析

四、 总结

参考文献(第二部分)

附录(文章发表情况)

致 谢