短指（趾）和缺指（趾）畸形的分子遗传学研究

摘要

新生儿中四肢先天畸形的发生率为1/500到1/1000。单独发生的四肢畸形一般不会危及患者生命，但是严重影响其生活质量。近年各种遗传性肢端骨骼畸形的致病基因陆续被发现，鉴定这些基因并研究其致病机制，可以为这些疾病的遗传咨询奠定基础，可以丰富发育生物学的知识，从而为更多种遗传性或非遗传性骨骼疾病的预防和治疗提供靶点。本文研究集中于常染色体显性遗传的肢端骨骼缩短或缺失畸形，包括短指(趾)畸形和缺指(趾)畸形。研究对象为5个表型不同但发生机制相关的中国人家系。研究工作分两部分。 第一部分短指(趾)畸形相关致病基因突变的研究短指(趾)畸形(Brachydactyly，BD)是指(趾)骨、掌(跖)骨发育异常导致的指(趾)缩短畸形。本文首先对以中节指骨缩短为共同表现的三个中国人短指(趾)畸形家系进行了致病基因突变研究研究。 其中一个家系(家系2)主要表型为C型短指(趾)畸形(BDC)伴掌跖角化(palmoplantar keratoderma，PPK)。迄今为止，国内外未曾有过类似表型报道。患者2、3和5指中节指骨缩短，为BDC特征性表现。部分患者生后数月丌始出现双侧手掌及足底皮肤弥散的黄色增厚斑块。我们分别针对BDC和BDAl的致病基因IHH和GDF5设计PCR引物，扩增全部外显子和外显子/内含子交界区，对患者基因组DNA测序。结果在患者中均发现GDF5基因新突变c.146lT>G(p.Y487X)，在家系正常成员及50名无关正常个体中均未检到该突变。因此，该无义突变是BDC患者中的致病突变。根据我们目前掌握的家系资料不能确定该家系中全部BDC患者都伴发PPK，加之又无GDF5基因与皮肤发育或生理相关的文献报道，因此尚不能确定新发现的GDF5基因突变也是导致患者发生PPK的遗传基础。为了进一步检测GDF5基因新突变对蛋白加工分泌的影响及其与PPK发生的关系，我们通过基因转染实验进行了初步功能研究。将正常野生型及突变型的GDF5基因克隆并引入c-myc标签序列，利用逆转录病毒载体系统感染永生化皮肤角质形成细胞HaCat，建立稳定整合细胞系。应用抗c.myc抗体对培养细胞裂解物和培养上清进行Western印迹检测，证实突变蛋白不能像野生型蛋白那样分泌到细胞外；通过RT-PCR对培养细胞的角质形成细胞分化标记基因IVL和KRT10进行mRNA表达检测，发现在整合野生型和突变型GDF5基因的细胞中表达水平均降低，突变基因表达引起的降低更显著。因此，GDF5基因发生c.146lT>G(p.Y487X)突变，和已报道的突变一样通过蛋白滞留在细胞内这一机制导致BDC发生。同时，突变GDF5基因表达可能干扰角质形成细胞分化，进而导致PPK。GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)突变与PPK发生相关的明确结论有待进一步的实验来验证。 另一个家系(家系1)为典型B型短指(趾)畸形(BDB)。国外在BDB患者中发现的ROR2基因致病突变集中于第8和第9外显子，国内虽有家系报道但无ROR2基因突变研究。我们针对ROR2基因内已知致BDB的突变区域设计引物，PCR扩增患者基因组DNA中目的片段，并将PCR产物片段直接测序及克隆至T载体测序，进行致病突变检测。结果显示，患者携带一个杂合移码突变c.1398-1399insA(P.R467fsX523)。该突变是国外已报道过的BDB家系致病突变。C.1398-1399 insA(p.R467fsX523)可能是BDB中一种频发的致病突变。 第三个家系是SYM1。迄今为止，国内尚无中国人SYM1家系文献报道。该家系中患者除中节指骨缩短外，还表现第1掌骨缩短，第5指远节指骨缩短且指甲发育不良，绝大多数近端指骨间关节及多数远端指骨间关节骨性融合，多处跗骨间关节骨性融合；另外患者听力差，中耳检查见鼓膜异常。我们选择BDA1、BDB和BDC的致病基因附近微卫星标记进行家系成员基因型和连锁分析，同时在患者中进行以上三个致病基因全部或部分外显子测序分析，均未发现支持BDA1、BDB和BDC的遗传证据。进一步对编码noggin蛋白的NOG基因进行测序分析，发现患者均具有一个错义突变c.142G>A(p.E48K)。在家系正常成员及50名无关正常个体中未检到该突变；NOG基因第48位密码子编码的谷氨酸从鱼到人都高度一致，p.E48K突变氨基酸极性变化显著。因此，该突变应该是SYM1的致病突变。此外，在一名SYM1伴卵巢功能早衰(premature ovarianfailure，POF)的R本患者中，曾有人发现该突变。我们的发现不仅明确了c.142G>A(p.E48K)的致病突变性质，同时还提示该突变可能在亚洲人SYM1中多见。 总之，本部分研究了三个中国人短指(趾)相关畸形家系中致病基因的结构和功能异常。其中在一个家系中发现的BDC伴掌跖角化的表型组合及GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)无义突变都是国际首次。对野生型和突变GDF5基因进行功能研究，首次发现GDF5基因表达抑制皮肤角质形成细胞分化标记基因表达，并且突变基因抑制更显著。另外两个家系中发现的致病突变在国外已有报道，为中国人相关致病突变研究的首报。 第二部分缺指(趾)畸形致病突变的鉴定缺指(趾)/手足裂畸形(ectrodactyly/split-hand/split-foot malformation，SHFM)是一种严重影响患者精细活动的先天性肢端畸形，是四肢端骨(autopod)中部指轴发育不全而剩余指(趾)呈不同模式的融合，典型表现即所谓龙虾爪(中部指轴缺陷)、或独指(桡侧指轴缺陷而无裂隙，第5指[趾]总不受累)。SHFM可以单独发生，或者伴随其它四肢骨骼畸形，或者伴随并非四肢骨的其它器官发育异常。其遗传方式有多种，已报道过的有典型的常染色体显性遗传、不规律的常染色体显性遗传(表现为外显率降低、表现度变异)、常染色体隐性遗传和X染色体遗传等。绝大多数单独发生的SHFM呈几乎完全外显的典型常染色体显性遗传传递。目前已定位的人类SHFM遗传位点包括：SHFM1(MIM 183600)、SItFM2(MIM 313350)、SHFM3(MIM 600095)、SHFM4(MIM 605289)和SHFM5(MIM 606708)，分别位于人染色体7q21、Xq26、10q24、3q27和2q31。因此，SHFM也是一种表现临床和遗传异质性的先天性肢端畸形。SHFM3和SHFM4位点上的致病突变已经明确，分别是染色体10q24区域内约0.5Mb的DNA串联重复和染色体3q27区域内TP63(OMIM 603273，亦称p63、TP73L等)基因的点突变。国内外尚无在中国人SHFM家系发现致病突变的报道。 在本部分研究中，我们利用收集到的两个中国人SHFM家系进行了遗传位点和致病突变研究。首先对家系中患者进行了临床体检，拍摄畸形部位外观照片及x光照片。进一步的实验研究工作包括：对家系成员外周血细胞进行高分辨染色体G显带分析；对SHFM4位点处TP63基因全部外显子及外显子/内含子交界区设计并合成引物，以患者基因组DNA为模板进行PCR扩增和产物直接测序；在已知的5个SHFM位点染色体区域选择微卫星标记，通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析家系成员的基因型和单体型：对家系中患者进行染色体10q24.3区域SHFM3位点内微卫星标记多态片段的测序分析，比较患者和基因型相同的正常对照个体不同等位片段测序峰高度的差别，借以检测DNA重复。 两个SHFM家系患者的缺指(趾)表型及传递规律有所不同。一个家系(家系4)患者呈典型而严重的手足裂畸形(手为独指畸形，足为龙虾爪畸形)，患者表型相似，并呈典型的常染色体显性遗传。另一家系(家系5)患者表型轻重不一，重者呈典型龙虾爪样畸形，轻者只有膜性并指或个别指骨缺失；该家系中患者畸形足重于手，均有手或足的第一指(趾)的宽大或复制畸形；虽为常染色体显性遗传方式，但有表现度变异。高分辨染色体G显带分析结果显示：两个家系患者均未见染色体数目异常和结构畸变；对TP63基因进行测序亦都未发现突变。微卫星标记基因型分析结果提示表型典型的家系中致病突变可能位于SHFM2或SHFM3位点。与正常个体相比，该家系全部患者都在SHFM3位点微卫星多态标记表现患者共享等位片段信号明显增强，患者测序图中该等位片段峰高明显增加。这一现象表明患者发生SHFM3位点内的DNA重复突变。在另一存在表现度变异的家系中，微卫星标记分析数据排除了其致病突变与SHFM2-SHFM5四个位点连锁的可能；而染色体7q21区域S}tFM1位点内有两个标记在0=0时，得到最大LOD值1.51，提示该家系致病突变可能位于该位点。 综上所述，我们首次在中国人SHFM家系患者中对五个SHFM位点进行了微卫星标记基因型分析，以及SHFM3位点内微卫星标记测序.半定量分析。在一个SHFM家系中确定致病突变为染色体10q24.3区域的DNA重复，在另一SHFM家系中获得支持定位于染色体7q21的连锁分析结果。

目录

第一部分短指(趾)畸形相关致病基因突变的研究

前言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分缺指(趾)畸形致病突变的鉴定

前言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

小结

文献综述：短指(趾)畸形的分子遗传学研究进展

个人简历

致谢