一、Man2c1基因表达抑制经有丝分裂阻滞及凋亡诱导抑制食管癌细胞生长;二、8B7血影蛋白的细胞内定位

摘要

本论文的第一部分是Man2cl基因表达抑制经有丝分裂阻滞及凋亡诱导抑制食管癌细胞生长。 本实验室于2000年克隆到了人α—甘露糖苷酶Man2cl cDNA，GenBank登记号为AF044414，此cDNA长3123bp，编码产生的α—甘露糖苷酶长1040aa，分子量在去糖基化状态下为116kDa。鞠吉雨师兄用腺病毒介导的RNAi技术抑制Man2cl基因在人食道癌细胞株EC9706的表达，得到两株Man2cl基因表达显著抑制的EC9706细胞(B7和D2)。本研究发现，B7和D2细胞在体外培养中的生长和集落形成明显抑制，它们接种裸鼠皮下的成瘤性生长明显减慢。流式细胞仪分析见细胞在S和G2/M期聚集，并出现sub—G0/G1峰，提示细胞发生凋亡。 本文对此现象的机制进行了探讨。首先分析了细胞的有丝分裂状况，见与对照细胞相比，B7和D2细胞的有丝分裂阻滞于M检验点。由于真核细胞的很多重要功能如细胞分裂均依赖细胞骨架，用抗α-Tubulin单抗免疫荧光染色细胞骨架，显示B7和D2细胞的微管结构变得模糊，并且在核周聚集，有些细胞还有长的胞质性突起。用抗α-Tubulin单抗作Western印迹检测，见B7和D2细胞中聚合的α-Tubulin减少。这些数据显示，Man2cl抑制导致EC9706细胞恶性生物学行为减弱的可能机制之一是，α-Tubulin聚合受阻，影响微管重排，导致细胞有丝分裂阻滞，从而诱发凋亡。E—cadherin—catenin复合物表达增加在Man2cl抑制导致EC9706细胞恶性生物学行为减弱中可能也起作用。 本论文的第二部分是8B7血影蛋白的细胞内定位与功能研究。 8B7 cDNA是本实验室从人扁桃体细胞λgtll cDNA文库克隆得到的一个cDNA，GenBank登记号为AF043290。8B7 cDNA长1835 bp，88—1179bp为开放阅读框，编码363个氨基酸的蛋白质分子。因为从8B7cDNA推断的编码蛋白质含有血影蛋白重复序列(spectrin repeat，SPEC)，将其编码蛋白质命名为8B7血影蛋白。 8B7血影蛋白是Nesprin蛋白家族的1个新成员。Blast分析显示，8B7 cDNA与EnaptincDNA、Nesprin—1 cDNA、Myne—1 cDNA及Syne—1 cDNA的3’端1835 bp核苷酸序列100％同源，8B7血影蛋白与Enaptin蛋白、Nesprin—1蛋白、Myne—1蛋白及Syne—1蛋白的C末端363个氨基酸序列100％同源。已发现的Nesprin蛋白家族成员有Syne—1、Syne—2、Nesprin—1、Nesprin—2、Myne—1、Myne—2、Enaptin和Nuauce等20余种，这些成员都是nesprin—1giant和nesprin—2giant基因变位剪接的产物。8B7是由nesprin—1giant的第141到147个外显子编码产生的。本实验室以往的Northern印迹检测显示了8B7 cDNA存在于人组织中。本人制备了抗8B7血影蛋白的单抗，用此单抗作探针，Western印迹检测表明了此蛋白存在于人细胞中。Nesprin蛋白家族成员含有KASH结构域和肌动蛋白结合结构域，主要定位在核膜，在核内、胞浆和细胞器中也有广泛分布。8B7血影蛋白小，缺如N末端的肌动蛋白结合结构域，只有C末端的KASH结构域和两个血影蛋白重复序列。8B7血影蛋白在核膜的定位表明，是KASH结构域决定了8B7血影蛋白在细胞内的定位。 已发现的定位于核膜的Nesprin蛋白家族成员的功能包括：参与核膜的崩解和重建；参与胞质分裂；参与细胞骨架的构建与调节；与内核膜蛋白及异染色质交联，可能在核膜形成一个复合物，通过桥联将细胞核和细胞骨架结构连接起来。刘荣师姐曾利用酵母双杂交技术筛选到可能与8B7血影蛋白相互作用的30余种蛋白质。本文藉免疫共沉淀检测了8B7血影蛋白与Dynactin(P62)、Stathnun、Emerin及LaminA间的关系，结果只见8B7和Lamin A可以在体外共沉淀。Lamin A是核纤层的组成成分，由LMNA基因编码，是核内许多蛋白分子的共同锚定物，在维持核膜的正常形态，提供染色质的锚定位点以及在核的重组过程中可能发挥重要作用。8B7血影蛋白可能经由Lamin A发挥功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 Man2c1基因表达抑制经有丝分裂阻滞及凋亡诱导抑制食管癌细胞生长

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

1.Man2c1基因表达抑制导致EC9706细胞在培养中的生长减慢

2.Man2c1基因表达抑制导致EC9706细胞的成瘤性生长减弱

3.Man2c1基因表达抑制导致EC9706细胞有丝分裂阻滞和细胞凋亡

4.Man2c1基因表达抑制导致EC9706细胞的骨架重排

5.Man2c1基因表达抑制导致EC9706细胞的E-cadherin-catenin复合物表达增强

五、讨论

参考文献

第二部分8B7血影蛋白的细胞内定位

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

1.8B7 cDNA编码1个分子量为41 kDa的血影蛋白

2.8B7血影蛋白是nesprin-lgiant蛋白N-端截断的蛋白质，是Nesprin蛋白家族的一个新成员

3.8B7血影蛋白天然存在于人细胞中

4.8B7血影蛋白主要定位在核膜，在胞浆有点状分布

5.KASH结构域决定了8B7血影蛋白的核膜定位

6.8B7血影蛋白与Dynactin、Stathmin、Lamin A及Emerin的免疫共沉淀分析

五、讨论

参考文献

第三部分用siRNA抑制CD44表达致CD44高表达鼻咽癌细胞恶性生物学行为减弱

小结

附录 缩写词对照表

综述 核内的血影蛋白超家族

致谢

个人简历