新发现的人类Boca病毒与儿科呼吸道感染相关性的初步研究

摘要

2005年9月，瑞典科学家Allander等人报道在人类呼吸道标本中检测到一种细小病毒样核苷酸序列，所推导的氨基酸序列与牛细小病毒及犬微小病毒同源性较高，而与人细小病毒B19也有同源性，但是很低。由于细小病毒B19自70年代被分离、80年代被确定为病原体后，一直被认为是已知的唯一对人类致病的细小病毒，说明这一新发现的病毒是一种新的对人类致病的细小病毒。现在暂时将这一新发现病毒命名为人Boca病毒(HBoV)。但HBoV的致病性尚无定论，HBoV究竟是病原还是过客？是否存在与腺病毒相关性细小病毒的无症状感染相似的无症状呼吸道感染？作为一种新近报道的病毒，HBoV是久已存在刚被发现，还是确实是一种新出现的病毒？它在人群中的流行情况如何？北京地区儿童的呼吸道感染是否与这种病毒有关？这一系列问题的回答只有依靠更多的研究、更多的资料积累。 为了了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与HBoV的关系，选择了这一研究课题。最初选择2003年11月至2004年10月收集的经间接免疫荧光和/或病毒分离进行了常见呼吸道病毒检测的急性呼吸道感染患儿标本728例，应用针对HBoV的NP1基因的PCR引物进行HBoV基因片段检测，选取HBoV基因检测阳性标本中的5例，对其PCR扩增产物直接进行核苷酸序列测定。将所测到的序列与GenBank中的基因序列进行比较分析，以确证所用方法的可靠性。所检测的728例标本中有17例有预期大小的基因片段扩增，提示为HBoV阳性，其阳性检出率占本组检测标本的2.3％，其中一例合并有腺病毒的感染；基因序列分析表明选取的HBoV基因检测阳性的5例北京的HBoV之间基因序列的同源性在99.7～100％之间，与ST1、ST2株的同源性为99.2～99.4％，确证有预期大小的基因片段扩增的标本确实是HBoV阳性；HBoV阳性检出率在本组的毛细支气管炎患儿中最高，达7.3％(6/82)，其次为支气管炎(3/69，4.2％)的患儿；HBoV检测阳性标本的患儿年龄主要分布于5个月～5岁，尤其是<1岁的患儿中；其中8～9个月的患儿中HBoV检测阳性的占18.8％(3/16)，9～10个月的患儿中阳性的占11.8％(2/17)；在<5个月的总计211例患儿中以及>5岁的69例患儿中均未检测到HBoV阳性标本。这一结果提示北京地区部分儿科患者的急性呼吸道感染与HBoV有关，且HBoV感染在小年龄组儿童中更为常见。 为了了解北京地区人Boca病毒(human bocavirus，HBoV)的基因组编码特征，并对其基因组编码的非结构蛋白NS1、核蛋白NP—1以及病毒外壳蛋白VP1及VP2的二级结构等特性进行预测分析，从已确证为HBoV阳性的两份临床标本BJ3064、BJ3722中应用针对NS1、NP—1、VP1、VP2、基因组3’末端的引物对扩增得到预期片段，PCR产物直接测序后得到基因组序列，将其上传至GenBank；运用生物信息学的方法，对HBoVBJ3064基因组编码的NS1、NP—1以及VP1、VP2的二级结构及其它生物学特性进行了预测分析。结果显示HBoVBJ3064及BJ3722基因组序列全长分别为5299bp、5300bp，共有四个主要的CDS(coding domain sequences)，分别编码NS1、NP—1、VP1、VP2蛋白。序列同源性比较结果显示BJ3064与BJ3722间基因组序列的同源性达99.9％；与ST1比较，同源性为99.4—99.5％；与ST2比较，同源性为99.8％；与BPV及MVC比较，同源性低于45％；与细小病毒B19的同源性仅为5％左右；基因组系统进化树分析显示BJ3064、BJ3722与ST2在一簇中，ST1属另一簇。NS1、NP—1、VP1及VP2蛋白二级结构中主要为无规卷曲，其他结构如α螺旋、β片层，β转角在不同蛋白中占有不同比例；各蛋白均无明显的跨膜结构域；NS1、NP—1属不稳定蛋白，VP1、VP2属稳定蛋白。这一结果提示北京地区BJ3064、BJ3722基因组序列与瑞典科学家报道的原型株之间有很高的同源性；而对蛋白二级结构等生物信息学分析必将有益于蛋白的表达、分离纯化以及蛋白检测条件的选择。 目前为止，仅有少量的关于健康人群及急性呼吸道感染的婴儿体内HBoV特异性获得性免疫的报道，主要原因在于缺乏可分离到的病毒或病毒抗原以及标准的诊断方法。本研究分别利用原核表达系统及真核表达系统进行了HBoVVP2蛋白的表达。在利用原核表达系统的研究中，首先从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经聚合酶链反应(PCR)扩增得到HBoVVP2蛋白编码区基因片段，将其克隆至pUCm-T载体中，然后再亚克隆至原核表达载体pET30b(+)，经双酶切、PCR、序列测定等方法挑选、鉴定阳性克隆，得到重组表达质粒pET30b—VP2，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达，再对得到的蛋白表达产物粗提物经Ni2+进行亲和层析纯化。通过改善表达及纯化条件，得到了较大量的HBoVVP2蛋白表达；然后利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV—VP2多肽免疫血清、抗细小病毒B19VP2特异性抗体以及人血清进行抗原性初步分析，初步证明表达产物具有抗原特异性，与细小病毒B19抗体无交叉反应。 随后以所表达的HBoVVP2蛋白为抗原，应用Western—blot方法，对两组血清标本进行HBoVVP2蛋白特异性IgG抗体检测以初步了解北京地区人群中这种新发现的病毒的感染状况。其中一组为1996年4月至1997年3月取自首都儿科研究所附属儿童医院健康查体者及北京宣武医院非呼吸道感染患者的血清标本，共计677份；另一组为2005年8月收集的20-60岁健康查体者的血清标本，共计141例。在第一组677份血清标本中，抗HBoVVP2蛋白IgG抗体阳性的400份，总检出率为59.1％。<1个月的婴儿抗体阳性率为45.3％，1个月～的婴儿抗体阳性率为41.4％，2个月～的婴儿抗体阳性率最低(31.3％)，6个月～至7岁龄～婴幼儿抗体阳性检出率在45.6％～69.7％，7岁后直至40岁，抗体阳性检出率维持在70％左右；50岁后则为61.8％～62.8％；在第二组141份血清标本中，抗HBoVVP2蛋白的IgG抗体阳性检出率为78.7％(111/141)。对两组血清标本进行相应年龄段的阳性检出率进行比较，发现2005年组的各年龄段明显高于1996—1997年组。可能的原因之一是标本的冻存时间不同，但不能排除随时间推移，感染率的增加。这一研究结果提示早在1996年北京地区的人群中就有59.1％曾经感染过HBoV，说明这种病毒是一种新发现的病毒而不是新出现的病毒，北京地区人群中该病毒的感染较常见。6月龄以前的婴儿为易感人群。 在病毒的基础研究中，VLPs可应用于病毒形态发生学、病毒的组装与复制、病毒出芽过程等多方面的研究，为研究病毒的功能，尤其是对于缺乏动物模型、不易于体外培养的病毒开辟了一个新的有效途径；而且是目前最有前景的防治传染病、肿瘤、以及过敏性疾病的候选疫苗。目前已发现有不少病毒的结构蛋白基因在真核表达系统中能有效的组装成病毒样颗粒。已有研究表明在细小病毒科成员中单纯的VP2蛋白即可形成病毒样颗粒(VLPs)。 本研究首先在杆状病毒表达系统中进行了HBoV VP2蛋白的重组表达。将来源于BJ3722的HBoV VP2编码区基因克隆至杆状病毒表达转移载体(pFastBacl)，通过转座反应，得到重组的Bacmid DNA，以此DNA转染昆虫细胞。收获重组病毒进行SDS-PAGE，通过考马氏亮蓝染色，应用兔抗HBoVVP2高价免疫血清进行Western—blot反应，均可检测到分子量约为61kDa的蛋白，表明有HBoVVP2蛋白的表达，而且所表达的蛋白具有抗原特异性。 对得到的重组病毒进行扩增培养。以0.5的感染复数(MOI)感染昆虫细胞7—10天后收获的培养上清，或感染4—5天后收获的细胞，经两次40％的蔗糖垫超速离心，通过和特异性的免疫血清共同孵育后在电镜下观察病毒样颗粒的形态结构。Western—blot检测结果显示经过两次蔗糖垫离心纯化后，与纯化前样品相比，杂蛋白数量明显减少，提示离心达到的一定的纯化效果：应用间接免疫荧光在所制备的细胞涂片上均检测到特异性的绿色荧光细胞；蛋白成分分析显示VLPs的成分为VP2蛋白。纯化后的样品经与特异性免疫血清共同孵育后在电镜下可见类似于天然的细小病毒B19的空壳结构的球形颗粒，直径20nm左右，这一结果确认成功构建了HBoV的VLPs。 综上所述，本研究对新发现的继细小病毒B19之后的第二类感染人类的细小病毒科成员HBoV进行了较为全面的系统性研究，完善了我国婴幼儿急性呼吸道感染的病毒病原谱，并为急性呼吸道感染的病原诊断提供了更加完善的技术平台；同时进行了大量的分子病毒学研究，为进一步的研究奠定了良好的基础；而HBoV病毒样颗粒的成功构建，也为下一步的研究工作积累了经验。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词对照表

声明

前言

(一)、从北京地区患急性呼吸道感染的婴幼儿中检测到人Boca病毒

材料与方法

实验结果

讨论

(二)、北京儿童中人Boca病毒全基因组序列及生物信息学分析

材料与方法

实验结果

讨论

(三)、北京儿童中人Boca病毒VP2蛋白的原核表达及其在血清学试验中的应用

材料与方法

实验结果

讨论

(四)、北京儿童中人Boca病毒VP2蛋白在杆状病毒中的表达以及病毒样颗粒的构建

材料与方法

实验结果

讨论

总结

参考文献

附录

论文综述 儿童中新发及再发呼吸道病毒研究进展

致谢