抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定

摘要

肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα，TNF-α)主要是由巨噬细胞分泌的一种多功能细胞因子，一方面它能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血性坏死；另一方面它又是一种较强的内源性炎症介质，过量的TNF-α表达可以引起组织损伤、重症感染性休克、自身免疫性疾病等，可以说TNF-α作为一个调节生理平衡的关键细胞因子，在人类对抗肿瘤及其他疾病中扮演了“双刃剑”的角色。依据TNF-α的双重作用，本实验课题主要分为两个部分，首先完成了一类TNF-α小分子抑制剂的设计、筛选及活性测定，其次对抗CD20Fab-TNFα融合蛋白在B系淋巴瘤中的功能作用进行了初步研究。 在过去的30年中，随着对某些炎性疾病如风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病及强直性脊柱炎在细胞和分子水平上病理机理的阐明，人们发现这些疾病之间有着共同的发生机制。而由TNF-α及其受体所构成的细胞因子信号通路网络在炎性疾病的发生发展过程中起着核心作用。阻断TNF-α活性已成为治疗上述免疫性疾病的主要手段。目前，国际上用于抗TNF-α治疗用药物主要有三种，皆为蛋白类药物，这些生物大分子一方面具有特异性好、结合能力强的特点，但另一方面也存在着稳定性较差，在患者体内易降解并极易产生免疫耐受的缺点。因此，探索新的免疫抑制剂研究策略来研制靶向抗TNF-α的小分子药物，已成为国内当前临床免疫治疗急需解决的难题之一。 本文利用计算机辅助药物设计(computer—aideddrugdesign，CADD)，以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板，从小分子化合物库中虚拟筛选出300-500个抗TNF-α的抑制剂，并购买其中的80个代表性化合物做进一步的生物活性测定。包括初步的抑制TNF-α对L929细胞毒性实验；流式细胞仪法测定筛选的小分子化合物阻断量子点标记的TNF-α结合受体的实验；MTT法进一步分析筛选出的小分子化合物在不同剂量时抑制TNF-α对L929细胞毒性的作用；采用AnnexinV—FITC检测上述小分子对TNF-α诱导的细胞凋亡的抑制作用。活性筛选结果显示有3个小分子化合物对TNF-α有显著抑制活性；对其中较好的一个进行了深入研究，实验结果表明，该化合物能特异性阻断量子点标记的TNF-α与受体的结合，并呈剂量依赖性；该化合物具有较强的抑制TNF-α(1ng/ml)对L929细胞毒性的作用，表现为剂量依赖性，半数抑制浓度(IC50)为10umol/L；该化合物能抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡，并呈剂量依赖性。实验证明，利用以上计算机虚拟筛选并结合人工筛选及生物学活性检测的方法能够发现针对特定靶点的小分子抑制剂。 尽管TNF-α在自身免疫性疾病中起到核心作用，但人们最初认识它却是作为一个能够诱导肿瘤细胞发生坏死的细胞因子。体外实验表明，TNF-α具有很强的抗增殖功能和细胞毒性。因此，在上个世纪80年代就被应用于恶性肿瘤的临床治疗当中。但全身系统性使用TNF-α治疗会产生一些严重的不良反应，限制了其应用。到目前为止，直接利用TNF-α杀灭肿瘤的治疗方法进展缓慢，仅局限于在隔离肢体灌注疗法中治疗黑色素瘤、骨肉瘤等。利用抗体的靶向作用将药物运输到目标部位已成为当前靶向治疗的主要手段和方法。已有研究表明，用单克隆抗体将TNF-α运送到肿瘤组织血管部位，使其在该部位浓集，可以达到破坏肿瘤新生血管从而杀灭肿瘤的目的。CD20是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质分子，主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统中起重要作用。其在B细胞中特有的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶点。研究表明，抗CD20的抗体可直接抑制B淋巴瘤细胞生长并诱导其凋亡的发生，该凋亡的发生与钙离子相关，并且CD20分子的二聚化和多聚化能够有效增强其诱导凋亡的能力。本实验在我室原有抗CD20Fab表达载体的基础上，成功构建了抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体并表达出可溶性蛋白，之后又对其活性进行了初步的研究探讨。证明了CD20Fab部分具有与Raji细胞表面CD20分子的结合能力，并验证了融合蛋白TNF-α部分的细胞毒活性。本实验的创新性在于期望利用CD20抗体的靶向作用将TNF-α用送到肿瘤部位以增强其诱导凋亡的作用，并且利用TNF-α在可溶状态下的自身三聚化可以使与之偶联的抗CD20Fab三聚化，从而达到B淋巴细胞表面CD20分子三聚化的目的。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分肿瘤坏死因子-α小分子抑制剂的设计、筛选及活性测定

1.1前言

1.2实验部分

1.3结论

1.4讨论

参考文献

第二部分抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达的构建、表达及活性的初步测定

2.1前言

2.2实验部分

2.3结论

2.4讨论

参考文献

全文总结

附录一溶液配制

附录二常见英文缩略词汇表

综 述TNF-a在肿瘤治疗领域中的研究进展

致 谢

个人简历