Ⅰ、CD133在人结肠癌细胞分化中的作用研究;Ⅱ、荧光标记肿瘤转移体内模型的建立

摘要

本论文分为两个部分：
　　 第一部分：CD133在人结肠癌细胞分化中的作用
　　 在本研究中，首先我们用Western blotting检测了44种人肿瘤细胞系中CD133的表达，其中8种细胞呈CD133阳性表达，5个来源于结肠癌。接着我们分选了结肠癌细胞系HCT116中CD133high和CD133。的亚群，发现CD133high的HCT116细胞在体外生长快于CD133-的HCT116细胞，并有更高的克隆形成率。CD133high亚群和CD133-的HCT116亚群细胞相比，S期和G2/M期细胞比例更高。但是在BALB/c-nu/nu鼠成瘤实验中，CD133high/+和CD133-的HCT116细胞并没有明显的区别。将分选后的CD133high/+和CD133-的HCT116细胞体外培养，CD133的分布趋向于和未分选前的HCT116细胞相同。我们的研究结果提示不能单用CD133一个分子标记来富集结肠癌细胞系中的肿瘤干细胞。
　　 我们进一步研究了CD133的表达和结肠癌分化的关系。我们按照CD133的表达量，将结肠癌细胞HT29分为了四个亚群，以ALP活性作为分化程度的指标进行了检测，结果显示不同亚群的分化状态和CD133的表达呈负相关。我们还发现用丁酸钠诱导HT29和HCT116分化后，流式检测这两种细胞表面的CD133/1和CD133/2的免疫活性都呈现时间和剂量依赖的下降。但是Western Blotting却未检测到细胞中CD133总蛋白水平的改变。我们还设计了三对针对人CD133分子的siRNA，其中两对可以在体外有效干扰CD133表达。但是干扰CD133的表达对HT29和HCT116细胞的增殖、克隆形成、周期分布和分化状态都没有明显的影响。CD133可能不是细胞生长和分化的调控基因。
　　 总的来说，CD133不是结肠癌细胞系HCT116特异的肿瘤干细胞的标记，而只是结肠癌分化相关的一个指标。
　　 第二部分：荧光标记肿瘤转移体内模型的建立
　　 本研究通过转染pEGFP-N1质粒，药物筛选后无限稀释得到了四株强表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞株-人宫颈癌细胞HeLa-GFP、人结肠癌细胞HCT116-GFP、人乳腺癌细胞MDA-MB-231-GFP和小鼠宫颈癌细胞U14-GFP。
　　 我们把HeLa-GFP以8×106个/只的剂量皮下接种于BALB/c-nu/nu裸鼠，成瘤潜伏期是3-5天，成瘤率为100％。利用Photometrics活体荧光成像系统连续观察，可以清楚直观的观察表达GFP的HeLa-GFP移植瘤在体内的生长。接种后第60天处死全部荷瘤鼠，解剖后大体成像仅有一只可见同侧腋窝下淋巴结的转移。取U14-GFP以8×106个/只接种C57BL/6J小鼠，移植成瘤的潜伏期是2-4天，成瘤率100％。利用Photometrics活体荧光成像系统连续观察，可分别在第22天、28天、37天和52天观察荷瘤小鼠肿瘤转移的发展过程。在U14-GFP原发瘤体积≥5 cm3时，肺部和淋巴结转移率分别为67％和100％。我们还将HCT116-GFP进行了皮下移植和尾静脉注射，用Berthold活体成像仪观察了肿瘤的生长和转移。利用Berthold活体成像系统可见HCT116-GFP移植瘤在体内仍可强表达GFP。HCT116-GFP尾静脉注射后第43天，可用Berthold活体成像系统检测到GFP阳性的皮下转移肿瘤。
　　 最后，我们还检测了两种常见的转移相关分子CD44和E-cadherin在HeLa-GFP和U14-GFP细胞移植瘤中的表达。免疫组化检测显示在两种移植瘤中都有CD44的表达，而无E-cadherin的表达。
　　 总之，我们成功建立了四株表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞株，体内移植建立了荧光标记的肿瘤转移模型。该模型可用于可视化肿瘤体内的研究。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

文献综述

一、CD133分子研究现状

二、肿瘤干细胞研究进展

第一部分：CD133在人结肠癌细胞分化中的作用

引言

实验材料

一、细胞系

二、实验动物

三、抗体

四、培养基及主要试剂

五、主要耗材

六、主要储备液及工作液的配制

七、主要仪器

实验方法

一、细胞培养

二、细胞总蛋白的提取

三、BCA法检测蛋白浓度

四、western Blotting

五、流式细胞仪分析及分选

六、细胞免疫化学染色

七、细胞分析计数仪检测细胞大小的分布状况

八、MTT法检测细胞增殖

九、细胞克隆形成率测定

十、流式检测细胞周期

十一、体内移植实验

十二、Transwell体外迁移实验

十三、实验性转移观察（尾静脉注射）

十四、ALP活性的检测

十五、siRNA干扰CD133的表达

十六、统计学方法

实验结果

一、CD133在44种人肿瘤细胞系中的表达

二、CD133high/+和CD133-HCT116细胞的差别

三、CD133与结肠癌细胞分化的关系

四、通过siRNA下调CD133表达对HCT116/HT29细胞生长、分化的影响

讨论

第二部分：荧光标记肿瘤转移体内模型的建立

引言

实验材料

一、细胞系

二、实验动物

三、菌株

四、质粒

五、抗体

六、培养基、主要试剂及耗材

七、主要储备液及工作液的配制

八、主要仪器

实验方法

一、细胞培养

二、质粒转化、扩增

三、质粒小量提取

四、酶切鉴定pEGFP-N1质粒

五、琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物

六、质粒大量提取

七、质粒转染

八、转染后细胞的克隆培养

九、体内移植荧光标记的肿瘤细胞

十、活体成像观察肿瘤的生长和转移

十一、制作组织冰冻切片

十二、制作组织石蜡切片

十三、冰冻组织切片伊红-苏木素染色

十四、冰冻组织切片间接免疫组织化学

十五、组织石蜡切片伊红-苏木素染色

十六、组织石蜡切片间接免疫组织化学

十七、流式细胞仪检测CD44在细胞系中的表达

实验结果

一、酶切鉴定pEGFP-N1质粒

二、GFP阳性细胞的单克隆培养

三、建立了100％表达GFP的单克隆细胞株

四、体内生长曲线

五、活体成像

六、U14-GFP移植模型的组织病理学

七、肿瘤转移相关分子的检测

讨论

参考文献

附录1：CD133在人肿瘤细胞系中的表达

附录2：已发表文章

致谢

个人简历