甲状腺激素受体α1与类胰岛素生长因子结合蛋白6相互作用及其成骨细胞分化的调节

摘要

类胰岛素生长因子结合蛋白6（IGFBP-6）是类胰岛素生长因子（IGF）结合蛋白家族成员，在细胞生长过程中具有依赖或不依赖IGF的活性。IGFBP-6通过抑制IGF-Ⅱ的作用直接抑制肿瘤的发生，但是在一些情况中，IGFBP-6却与肿瘤的发生及转移相关，这显然不是IGF-Ⅱ抑制的结果。IGFBP-6的这一矛盾作用的分子机制至今不清楚。在之前的研究中，其他研究者和我们都已经证明IGFBP-6具有进入细胞核的性质。但是IGFBP-6在细胞核内的作用所知甚少。甲状腺激素(TH)在个体发育、维持内环境稳定、细胞增殖和分化方面均有广泛的作用。TH结合甲状腺激素受体(TR)，包括TRα和TRβ。TR属于核激素受体超家族，调节正向和负向基因转录。在缺少配体时，TR结合特异DNA序列，通过和共抑制子相互作用主动抑制转录。配体的结合导致TR结构改变，释放共抑制子并招募共激活子而激活转录。甲状腺激素调节骨细胞分化，可以诱导成骨细胞分化使细胞周期停止在G0/G1期并促进骨基质蛋白表达。IGFBP-6在骨生长和成骨细胞中的功能还不清楚。
　　 本研究通过GST-pulldown实验证明IGFBP-6可以在体外直接结合甲状腺激素受体α1(TRα1)和维甲酸X受体α(RXRα)，干扰TRα1与RXRα异二聚体的形成。IGFBP-6可以在体外直接结合TRα1DBD和LBD。IGFBP-6的C端结构域是与TRα1作用的主要结构域，IGFBP-6的N端结构域也参与作用。突变IGFBP-6的LXXLL模体不影响与TRα1的相互作用。通过细胞免疫荧光共聚焦显微镜观察到TRα1和IGFBP-6可以共定位于HEK-293，MG-63和Hela细胞。通过免疫共沉淀实验证明在全细胞裂解液和细胞核抽提物中，过表达TRα1和IGFBP-6的HEK-293细胞中存在两蛋白的相互作用。通过FRET实验证明在HEK-293细胞中TRα1和IGFBP-6两蛋白之间有能量转移现象，说明在细胞内两蛋白可以相互作用。通过双萤光素酶实验证明结合了T3的TR作用于生长激素启动子，因此刺激含TRE的启动子的基因表达，但过表达IGFBP-6则明显抑制这一作用，并且随着IGFBP-6转染质粒量的增加抑制作用增强。通过real-timeqRT-PCR实验证明T3增加成骨细胞骨钙素的mRNA，但过表达的IGFBP-6可以抑制这一作用。通过流式细胞技术检测U20S细胞周期，IGFBP-6减弱由T3引起的G0/G1期停止作用。通过real-timeqRT-PCR实验证明在T3作用下，过表达IGFBP-6抑制HEK-293细胞中cyclinD1，Ki67表达。通过碱性磷酸酶实验证明T3引起的碱性磷酸酶的活性增加能够被过表达的IGFBP-6明显抑制。这些结果证明IGFBP-6与TRα1相互作用并干扰TRα1：RXRα异二聚体的形成，提示IGFBP-6具有抑制T3引起的骨细胞分化标志物表达的作用，并且调节T3对成骨细胞的细胞周期进程的影响。