近平滑念珠菌和都柏林念珠菌的表型和基因型研究

摘要

本论文分两部分介绍：第一部分近平滑念珠菌复合体表型与基因型研究
　　 第一章近平滑念珠菌复合体的筛选、测序鉴定和种系进化分析
　　 目的研究我国华东地区近平滑念珠菌复合体的菌种分布和种系进化关系。方法利用科玛嘉念珠菌显色培养基和API20C AUX生化系统对分离自华东地区4个城市的80株临床株进行表型鉴定。经生化鉴定为近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、无名念珠菌和葡萄牙念珠菌的菌株进一步进行ITS区测序分子鉴定,构建基于ITS区序列的种系进化树,分析近平滑念珠菌复合体中菌株的种系亲缘关系。结果80株临床株中,60株菌株(75％)经生化系统鉴定为近平滑念珠菌,11株(13.75％)为光滑念珠菌,4株(5％)为季也蒙念珠菌,葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、涎沫念珠菌、郎比卡念珠菌和无名念珠菌各1株(1,25％)。60株表型鉴定为近平滑念珠菌中,3株分子鉴定为季也蒙念珠菌,57株菌为近平滑念珠菌复合体,其中Candida parapsilosissensu stricto占71.9％(41/57),C.metapsilosis占28.1％(16/57)；未分离到C.orthopsilosis。菌种分布呈现显著的地域差异:来自南京、上海和济南的37株临床株中,C.parapsilosis sensu stricto占89.8％(33/37),C.metapsilosis仅占10.2％(4/37)；而来源于南昌的临床株中则以C.metapsilosis为主,占60％(12/20)。基于ITS区的种系进化树表明:C.parapsilosis sensu stricto进化上较为保守；C.metapsilosis和C.orthopsilosis种系亲缘关系更为紧密；C.metapsilosis存在两种分布不均的ITS基因型(Ⅰ和Ⅱ),以Ⅱ型为主。结论(1)近平滑念珠菌复合体在我国华东地区的菌种分布存在地区差异；(2)C.metapsilosis菌株中存在差异分布的ITS基因型。
　　 第二章近平滑念珠菌复合体的PCR-RFLP和RAPD鉴定分型研究
　　 目的构建和评价用于近平滑念珠菌复合体分子鉴定的PCR—RFLP和RAPD—PCR方法,并进一步对临床株进行RAPD指纹分型和聚类分析。方法(1)POM—StuI/StyI酶切法:设计近平滑念珠菌复合体特异性引物POMf/r扩增ITS区的种间多态性片段POM,PCR扩增POM片段,后分别刚StuI和StyI进行酶切反应。(2)随机引物RPO2进行RAPD-PCR扩增临床株基因组多态性片段,形成RAPD指纹,并对RAPD指纹进行聚类分析。结果(1)POMf/r特异性扩增C.parapsilosis sensu stricto,C.orthopsilosis和C.metapsilosis标准株和临床株的ITS区POM片段,经StuI和StyI酶切后形成种特异性RFLP条带,与测序鉴定结果一致。(2)RPO2-RAPD反应产生C.parapsilosis sensu stricto和C.metapsilosis种特异性RAPD指纹图谱；RAPD指纹聚类分析表明:C.metapsilosis存在2种差异分布的基因型,与ITS基因型相一致。结论(1)POM-StuI/StyI酶切法可以实现近平滑念珠菌复合体的快速而准确的分子鉴定；(2)RPO2-RAPD也可以实现C.parapsilosis sensu stricto和C.metapsilosis快速分子鉴定；(3)C.metapsilosis存在2种差异分布的RAPD基因型,与ITS基因型一致。
　　 第三章近平滑念珠菌复合体药物敏感性研究
　　 目的测定近平滑念珠菌复合体对常见抗真菌药物的敏感性。方法参照美国CLSIM27-A3指南进行药敏试验,检测近平滑念珠菌复合体临床株对两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和米卡芬净的敏感性。结果所有菌株对两性霉素B、氟康唑、伏立康唑和米卡芬净均敏感,6株C.parapsilosis sensu stricto和3株C.metapsilosis对伊曲康唑呈剂量依赖性敏感。未发现耐药株。结论临床上近平滑念珠菌耐药株罕见,常见抗真菌药物可以有效治疗近平滑念珠菌感染。
　　 第四章近平滑念珠菌复合体胞外水解酶研究
　　 目的检测34株近平滑念珠菌复合体菌株(21株C.parapsilosis sensu stricto,1株C.orthopsilosis和12株C.metapsilosis)产生胞外水解酶的能力。方法利用卵黄培养基、胎牛白蛋白培养基和吐温-80培养基分别检测近平滑念珠菌复合体菌株产生磷脂酶、蛋白酶和酯酶的能力。结果(1)磷脂酶活力:90.5％(19/21)C.parapsilosissensu stricto和91.7％(11/12)C.metapsilosis菌株产生磷脂酶活力,两种真菌酶活力无显著性差异,C.orthopsilosis标准株未检测到磷脂酶活力；(2)蛋白酶活力:81.0％(17/21)C.parapsilosis sensu stricto和83.3％(10/12)C.metapsilosis菌株表达蛋白酶活力,前者活力更强；C.orthopsilosis标准株表达极强水平的蛋白酶活力；(3)酯酶活力:仅有4.76％C.parapsilosis sensu stricto(1/21)和16.7％C.metapsilosis(2/12)表达酯酶活力,C.orthopsilosis标准株未表达酯酶活力。结论本研究中C.parapsilosis sensu stricto,C.metapsilosis与白念珠菌类似,均高表达磷脂酶和蛋白酶活力,但酯酶活力极低。
　　 第二部分都柏林念珠菌的鉴定方法研究
　　 第五章都柏林念珠菌的经典表型方法与分子生物学鉴定方法研究
　　 目的比较6种都柏林念珠菌经典表型鉴定方法和构建、评价一种新的菌落PCR-RFLP分子鉴定方法方法(1)利用科玛嘉显色培养基、玉米粉吐温培养基厚壁孢子形成试验、45℃耐受试验、高渗培养基耐受试验、烟叶培养基形态学观察和API20C AUX生化鉴定系统等6种经典表型方法鉴定白念珠菌和都柏林念珠菌标准株和66株白念珠菌/都柏林念珠菌临床分离株；(2)菌落PCR-ApaI/BsiEI酶切法:菌落PCR扩增白念珠菌、都柏林念珠菌和其它8种常见致病酵母菌标准株的D1-D2区,用ApaI和BsiEI分别进行酶切鉴定；并对临床分离株进行分子鉴定。结果(1)高渗培养基耐受试验、烟叶培养基形态学观察可以准确鉴定白念珠菌和都柏林念珠菌标准株；66株临床株经表型鉴定均为白念珠菌；(2)菌落PCR-ApaI/BsiEI产生白念珠菌和都柏林念珠菌特异性RFLP带型,66株临床株经分子鉴定均为白念珠菌。结论(1)联合2种或更多种表型鉴定方法可以实现都柏林念珠菌的筛选和初步鉴定；(2)菌落PCR-ApaI/BsiEI可以实现白念珠菌和都柏林念珠菌的快速准确的分子鉴定。