TCRγδ-Ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究及功能性抗人TCRγδ抗体及单链抗体的制备和鉴定

摘要

二十余年来，肿瘤的抗体靶向治疗发展迅速。曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab)和利妥昔单克隆抗体(Rituximab)分别被用于靶向性治疗乳腺癌转移和非何杰金式淋巴瘤；并取得了良好的临床治疗效果。肿瘤靶向治疗的关键在于发现肿瘤特异性抗原。然而，已获鉴定的肿瘤特异性抗原数量较少，这大大限制了应用抗体进行肿瘤靶向治疗的发展。
　　 除了抗体，肿瘤浸润性T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor,TCR)也能特异地识别肿瘤抗原，这使之成为肿瘤靶向治疗的理想候选者。据报道，应用TCRαβ进行肿瘤靶向治疗的研究已取得了初步的进展。TCRγ9δ2在TCR缺失的JRT3-T3.5细胞中表达，能够赋予后者识别和杀伤肿瘤细胞的能力，表明TCRγ9δ2在γ9δ2T细胞对肿瘤细胞的杀伤中起着关键性作用。对肿瘤细胞的特异识别使TCRγ9δ2可能像抗体一样应用于肿瘤的靶向治疗。更重要的是，与TCRαβ相比，TCRγδ的抗原识别不受主要组织相容性复合物(Major histocompability complex，MHC)限制，其抗原识别谱可能更广。因此，TCRγδ应用于肿瘤靶向治疗可能也具有一定优势。
　　 本课题组致力于研究TCRγ9δ2在肿瘤靶向治疗中的作用。在前期工作中，本组在人卵巢上皮癌浸润性T淋巴细胞中获得了一个优势TCRδ2链互补决定区3(complementary determining region 3，CDR3)序列，将其命名为OT3。实验证明，TCRγ9δ2(OT3)是卵巢癌反应性的特异性TCR。用OT3取代抗体重链CDR3区，构建的CDR3δ(OT3)移植性抗体，保留了其与多种肿瘤细胞的结合特性，但亲和力较弱。为了获得既具有对肿瘤抗原的高亲合特性，又具有抗体生物学功能的融合蛋白，我们将TCRγ9δ2(OT3)的完整胞外段或可变区分别与人IgG1重链恒定区连接起来，构建了三种TCRγδ-Ig融合蛋白，即TCRγ9δ2(OT3)-Fc，TCRVδ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ。体外结合实验的结果表明，三种融合蛋白中，TCRγ9δ2(OT3)-Fc与卵巢癌细胞系和组织的结合能力最强。
　　 因此，本研究的第一部分工作，主要研究了TCRγ9δ2(OT3)-Fc的肿瘤结合能力和体内外抗卵巢癌效应。我们发现，除了卵巢癌，TCRγ9δ2(OT3)-Fc在体外能结合其他多种肿瘤细胞系，提示其可能具有广谱肿瘤靶向性;体外杀伤实验结果显示，TCRγ9δ2(OT3)-Fc的加入可以明显增强人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)对卵巢癌细胞系SKOV3和ES-2细胞的杀伤作用，并具有剂量依赖的特性。体内实验结果显示，在人卵巢癌移植瘤裸鼠模型中，与PBS对照组相比，TCRγ9δ2(OT3)-Fc能够有效抑制肿瘤生长，并延长荷瘤裸鼠的生存期。这些数据表明，TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白保留了TCRγδ的抗原识别特性，同时也兼具抗体Fc段介导的效应功能，将其应用于卵巢癌的靶向治疗是可行的。而且，由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc能结合多种肿瘤细胞系，具有潜在的广谱肿瘤靶向性，有望扩大肿瘤靶向治疗的应用范围。
　　 本研究的第二部分工作，主要是功能性抗人TCRγδ抗体的研究，以期用其扩增γδT细胞，应用于肿瘤的过继免疫治疗。在肿瘤免疫中，γδT细胞对肿瘤抗原的识别不具MHC限制性，能分泌大量干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ），且能杀伤多种肿瘤细胞系，从而具有用于肿瘤过继免疫治疗的潜能。由于γδT细胞仅占外周血T细胞的1～10％，获取足够数量且有相应生物学功能的γδT细胞，成为制约其应用于过继免疫治疗的瓶颈。目前获得用于过继免疫治疗的γδT细胞的方法有两种，一种是磷酸抗原刺激增殖，如4-羟基-3-甲基-2-己烯基-4-焦磷酸(HMBPP)，另一种是固相化抗体体外扩增；两种方法均需联合白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）。本课题组重点研究固相化抗体体外扩增的γδT细胞的过继免疫治疗。但是由于目前使用的抗TCRγδ单克隆抗体是鼠源的，有产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应的潜在危险，因而在临床治疗上受到一定限制。因此，本文第二部分的工作，旨在构建稳定分泌抗人TCRγδ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并在此基础上，构建人源化的抗人TCRγδ抗体或单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)。通过对人源化抗体或单链抗体的生物学功能进行分析，以验证其能否替代鼠源亲本抗体，用于制备过继免疫治疗的γδT细胞制剂。
　　 首先，我们以TCRγ9δ2(OT3)-Fc为免疫原免疫BALB/c小鼠，用常规杂交瘤技术获得能稳定分泌抗人TCRγδ抗体的杂交瘤细胞株。并用固相化抗体体外扩增的方法，筛选到分泌能体外扩增γδT细胞的单抗的杂交瘤细胞株--G5-4。
　　 其后，通过RT-PCR法，从杂交瘤细胞株G5-4的cDNA中分别扩增获得抗体的轻重链的可变区基因；并分别构建了嵌合抗体的表达质粒G5-4-pAc-κ-CH3和单链抗体的表达质粒G5-4ScFv-pET22b(＋)。嵌合抗体和单链抗体分别在在昆虫杆状病毒表达系统和大肠杆菌TransB(DE3)中得到成功表达。
　　 最后，重点对单链抗体G5-4ScFv的生物学功能进行了分析。结果表明，单链抗体G5-4ScFv能与TCRγδ特异结合；固相化G5-4ScFv能刺激人PBMC中γδT细胞增殖，2周时其纯度可达90%；扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系，如Daudi细胞；并在刺激时能有效分泌干扰素-γ（INIFN-γ）和TGF-α。提示，本实验成功构建并表达了具有生物学活性的抗人TCRγδ单链抗体G5-4ScFv，为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗的细胞制剂奠定了基础。
　　 综上所述，本文的研究有以下成果：
　　 1．我们构建并表达了具有较高亲和力的TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白，该蛋白兼具TCRγδ的抗原识别特性和抗体的效应功能。
　　 2．TCRγ9δ2(OT3)-Fc在体内外均表现出抗卵巢癌的功能，提示有应用于卵巢癌靶向治疗的前景。
　　 3.由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc的潜在广谱肿瘤识别特性，因此，它具有应用于多种肿瘤靶向治疗的可能性。
　　 4．成功构建了稳定分泌抗人TCRγδ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
　　 5．构建并表达了人源化的抗人TCRγδ抗体或单链抗体。
　　 6．单链抗体G5-4ScFv能与人TCRγδ特异结合，固相化后能有效刺激人PBMC中γδT细胞增殖，有望替代鼠源抗体用于制备过继免疫治疗的γδT细胞制剂。