骨髓增生异常综合征集落形成细胞体外培养特征及其与非重型再生障碍性贫血的比较研究;MLF1IP促进红系造血细胞的扩增并参与真性红细胞增多症的发生

摘要

MDS是一组异质性的起源于造血干细胞的克隆性髓系肿瘤,发育异常的MDS干、祖细胞表现为增殖和分化的异常[1]。集落形成细胞(colony-forming cell,CFC)培养是经典的造血祖细胞体外研究方法,是评估造血细胞功能的重要手段[2]。2006年维也纳MDS工作会议[3]提出,CFC的显著或持续减少可作为MDS诊断的辅助标准之一,但并未解释CFC减少的类型和程度。本研究对MDS患者CFC变化特征进行了分析,并结合其他临床特征与同为骨髓衰竭性疾病的非重型再生障碍性贫血(NSAA)患者进行了比较研究。旨在探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者体外集落形成细胞(CFC)培养特征,进而对此类骨髓衰竭性疾病的生物学特征进行分析。
　　 本研究回顾性分析了初诊未治的155例MDS患者的CFC培养结果及与其它相关实验室检查参数的相关性,并与初诊未治的122例非重型再生障碍性贫血(NSAA)体外CFC培养结果进行了比较分析。主要结果如下:
　　 ① MDS患者BFU-E中位数9(0-157)个/105BMNC,CFU-E中位数30(0-425)个/105BMNC,CFU-GM中位数14(0-125)个/105BMNC,较正常参考值均显著减少;66例(43.3％)BFU-E或/和CFU-E低于正常下限,3例(1.6％) CFU-GM低于正常下限,70例(43.9％) BFU-E或/和CFU-E且CFU-GM低于正常下限。
　　 ②骨髓涂片低原始细胞组(MDS-blast＜5％)较高原始细胞组(MDS-blast≥5％)集簇与CFU-GM的比值较低(0.65 vs1.0,p=0.049),两组内BFU-E和CFU-E均成正相关(rbla。t＜5％=0.728,p=0.000和rblast≥5％=0.696,p=0.000),且MDS-blast＜5％组内相关度较高(p＜0.05)。所有MDS中集簇数同BFU-E、CFU-E及CFU-GM数均成正相关性(r值分别为0.415、0.338、0.642,p值均为0.000),同中性粒细胞碱性磷酸酶(N-ALP)阳性率和阳性积分均成负相关性(r阳性率=-0.315,p=0.001和r阳性积分=-257,p=0.006)。
　　 ③ MDS组各类型集落中位数均明显高于NSAA组(BFU-E9 vs5, p=0.017, CFU-E30 vs19.5,p=0.023,CFU-GM14 vs10,p=0.003),两组内BFU-E和CFU-E均成正相关,相关系数分别为rMDS=0.712(p=0.000)和rNSAA=0.757(p=0.000),rMDS显著低于rNSAA(p＜0.05)。
　　 综上,本研究发现MDS患者在起病初期时就已经出现了造血祖细胞数量明显减少,且红系受累更为广泛而显著;并且证明了BFU-E、CFU-E和CFU-GM集落数能够反映出体内造血祖细胞水平但并不能代表残存的正常造血克隆,集簇数代表了发育异常祖细胞克隆但不等同于白血病样原始细胞;此外本研究以CFC体外培养特征为出发点,揭示出起病时原始细胞比例＞5％的MDS和原始细胞比例＜5％的MDS的发育异常造血祖细胞具有不同的生物学特征。
　　 人MLF1IP基因位于染色体4q35.1,其编码的蛋白具有多个经典的结构功能域;近年几个研究组先后证实MLF1IP参与了有丝分裂中着丝粒的组装,并通过募集相关蛋白等方式参与有丝分裂周期的调控。其同源基因在小鼠造血系统中被证实特异性表达于早期的红系造血细胞。本室筛查患者标本曾发现:真性红细胞增多症(PV)患者骨髓单个核细胞MLF1IP基因的表达水平显著高于正常对照。而PV正是一类以外周血HB异常增高为显著特征的骨髓增殖性肿瘤。因此我们推测MLF1IP可能参与了PV的发生,并在K562细胞中证实下调MLF1IP表达后集落形成数减低,细胞周期出现G2/M期阻滞,VP16诱导细胞凋亡增强。
　　 为了进一步探索PV发生中MLF1IP的功能和作用机制,我们用绝对定量PCR法检测了患者骨髓细胞体外培养集落形成单位中MLF1IP的表达,对不同类型集落的表达水平进行比较;并构建了MLF1IP转基因小鼠,对其血液学特征的改变及分子机制进行研究。本研究主要结果如下:
　　 1.应用绝对定量PCR的方法检测了22例PV患者骨髓细胞体外培养的红系和粒系集落形成单位85个,6例健康脐带血红系集落19个,8例MDS患者红系集落16个。结果表明,PV患者第7天红系集落形成单位中(EU1)中MLF1IP的表达水平显著高于MDS样本的同期红系集落;PV患者含EPO培养体系中收集的各型集落中,MLF1IP在EU1中表达水平最高,显著高于第14天的红系集落(EU2)和第7天的粒系集落(GMU)。
　　 2.应用vav-HS21/45启动子成功构建MLF1IP转基因鼠后,对其血液学改变进行分析发现,10-20周的转基因鼠HB和PLT水平显著高于同胞对照,并于20周时达到高峰;之后在40周时HB和PLT都较前减低,PLT降至与对照相同而HB仍高于对照;转基因鼠的整个生命周期内ANC都与对照无差异。
　　 3.小鼠骨髓细胞进行体外半固体培养,结果显示转基因鼠BFU-E数量高于对照,但CFUGM和混合集落数无显著差异,并且转基因鼠的BFU-E与同期对照相比集落形态明显变大形成血红蛋白更为致密。
　　 4.应用ELISA的方法检测小鼠血浆EPO水平,发现转基因鼠血浆EPO值较对照显著减低。
　　 5.小鼠骨髓细胞印染膜表面各系别标志性抗体,经流式细胞术分析发现转基因鼠与对照相比粒系与巨核系比例无差异;对两组骨髓内红系各分化阶段细胞所占比例分析,结果显示转基因鼠早期红系前体细胞(CD71highTER119med/CD71 highTER119highFSChigh)所占比例较对照明显增高;且40周以上转基因鼠这群细胞比例增高更显著,但骨髓内红系总量减低。
　　 6.取新鲜小鼠骨髓细胞固定后PI印染进行流式法细胞周期分析,结果显示转基因鼠骨髓中S/G2/M期细胞比例增加。
　　 7.相对实时定量PCR法检测小鼠骨髓细胞,发现转基因鼠cyclinD2和CDK1的表达水平较对照显著增高。
　　 8.通过Westem Blot法检测小鼠骨髓细胞细胞周期及增殖/凋亡通路上重要因子的表达水平,结果显示转基因鼠周期负调蛋白p21和p27表达水平下降,促增殖通路中p-stat5水平增高,且抗凋亡蛋白bcl-2表达增强。
　　 综上,我们首次发现PV中MLF1IP基因表达上调且尤以早期红系前体细胞最为显著,并证明了PV中MLF1IP遵循早期红系造血细胞中强表达,其他各系及成熟血细胞弱表达或不表达的模式;此外我们还在小鼠体内验证了,MLF1IP通过降低细胞周期中的抑制性效应,使进入活动性周期的红系定向祖细胞比例增加,促进了终末分化前早期红系前体细胞数量的扩增:以上结果揭示,MLF1IP凭借其特异性的表达模式与生物学功能参与了PV发生,这可能是PV区别于其他经典BCR/ABL阴性MPN的又一个重要病理生理环节。

目录

第一部分 骨髓增生异常综合征集落形成细胞体外培养特征及其与非重型再生障碍性贫血的比较研究

摘要

前言

病例和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 MLFIlP促进红系造血细胞的扩增并参与真性红细胞增多症的发生

摘要

前言

实验材料与仪器

实验方法

结果

讨论

参考文献

综述一 BCR／ABL阴性骨髓增殖性肿瘤的诊断和治疗

综述二 MLF1IP基因研究现状

附页 缩写词

在学期间发表论文和会议报告

致谢

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