应用基因芯片捕获和新一代高通量测序技术建立Duchenne/Becker型肌营养不良基因诊断平台及相关临床应用

摘要

第一部分基于目标序列捕获和高通量测序的DMD基因微小突变检测
　　 研究背景：
　　 Duchenne型/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)是最常见的肌营养不良类型。致病基因为DMD基因。这一基因是迄今为止发现的人类最大基因，有多达79个外显子。同时DMD基因有多种致病突变类型，其中占全部突变30％微小突变，一直是临床基因诊断的难点。随着DNA测序技术、基因芯片技术的发展，已可利用全新技术平台，实现DMD基因微小突变的检测。
　　 研究目的：
　　 建立基于目标序列捕获和高通量测序技术的平台用于检测DMD基因微小突变，并验证其敏感性和特异性。
　　 研究方法：
　　 以2名经临床诊断、病理确诊且未发现DMD基因大片段缺失或重复的DMD患者(XZX、YZY)和1名经病理诊断排除DMD的肌病患者(CDY)为研究对象，在盲法原则下，分别完成DMD基因全部79个外显子的Sanger测序和基于目标序列捕获和高通量测序技术的新平台测序，对比两种检测方法的结果。同时，以YH标准gDNA确立了新平台的数据过滤法则。
　　 结果：
　　 ①经Sanger测序，发现患者XZX外显子22存在c.2833位单核苷酸C缺失;患者YZY外显子44存在c.6391_6392双核苷酸CA缺失;患者CDY未发现致病突变。
　　 ②通过YH标准样本，确立“Ratio of Reads”=26.6％为用于检测的基因捕获芯片和高通量测序的最佳数据过滤法则。
　　 ③经Targeted capture NGS平台，同样发现XZX外显子22存在c.2833位单核苷酸C缺失;患者YZY外显子44存在c.6391_6392双核苷酸CA缺失;患者CDY未发现致病突变。同时发现一些不致病SNP。
　　 ④Targeted capture NGS测序与Sanger测序结果完全一致，是一种可供选择的DMD基因SNV检测方法。
　　 结论：
　　 1、Targeted capture NGS检测平台，对DMD基因SNV和INDEL的检测，具有较高的敏感性、准确性。
　　 2、与经典Sanger测序相比，Targeted Capture NGS平台具有周期短、花费少、结果稳定的优势。
　　 第二部分基于目标序列捕获和高通量测序的DMD基因大片段缺失或重复检测
　　 研究背景：Targeted capture NGS检测平台以往主要用于微小突变的检测。但通过精细操作和巧妙分析，是有可能用于基因CNV检测的。DMD为X连锁隐性遗传疾病，男性患者只有一条X染色体，更有利于通过测序深度分析来检测大片段缺失或重复。我们研究的同时，也有小样本回顾性研究将这一平台用于DMD基因的CNV检测。
　　 研究目的：通过严格操作流程和后期程序化的生物信息学分析，将Targeted capture NGS检测平台用于DMD基因CNV检测，真正成为DMD/BMD患者基因诊断的常规手段。
　　 研究方法：共有三组人群纳入研究:1、124名无家族遗传史的健康成年人（男性62名，女性62名），命名为健康对照组;2、41名DMD/BMD患者（男性40名，女性1名）以及8名先证者的无症状携带状态亲属（母亲或姐妹），命名为DMD组;3、245名DMD/BMD以外的其他单基因病患者（男性144名，女性101名），命名为non-DMD组。
　　 DMD组全部患者或携带者均经MLPA检测发现大片段缺失或重复。
　　 上述三组人群全部经Targeted Capture NGS检测平台检测，并通过公式计算标准化测序深度。健康对照组结果用来计算DMD基因每一外显子的标准化测序深度平均值和标准差。在盲法原则下，严格按计算公式和流程分析DMD组和non-DMD组的CNV情况。最后分析Targeted Capture NGS检测DMD基因CNV的敏感性和特异性。
　　 结果：
　　 1、MLPA检测发现DMD组全部患者及携带者均存在大片段缺失或重复，并以这一结果为标准。
　　 2、健康对照组targeted capture NGS检测结果显示，DMD外显子男性测序深度约为女性测序深度的一半，结果均一性良好，标准差不大。
　　 3、通过targeted capture NGS平台CNV分析计算流程所得出的CNV结果具有良好的敏感性(99.26％)和特异性(99.99％)。
　　 结论：
　　 1、利用创新性生物信息学分析方法，Targeted Capture NGS平台可用于DMD基因CNV检测，敏感性、特异性均良好。
　　 2、Targeted capture NGS检测平台更精确定位断裂点，可发现外显子部分缺失。
　　 第三部分 DUCHENNE/BECKER型肌营养不良全新基因诊断平台的建立及临床应用中新突变类型的发现
　　 研究背景：Duchenne型肌营养不良从报道至今已有180余年历史，疾病的诊断经历了从临床诊断至基因确诊的不同阶段。自1987年Southern印迹杂交首先用于DMD基因诊断，先后出现多重PCR、MLPA、微阵列比较基因组杂交、Sanger测序等多种检测方法。这些方法各有优劣，但没有一种方法可以一次性全面检测DMD基因各种类型突变。利用目标序列捕获、高通量测序等最新分子生物学技术，我们建立了targetedcapture NGS平台用于DMD/BMD的全方位基因诊断。
　　 研究目的：验证全新targeted capture NGS平台在DMD/BMD实际临床检测中的有效性和可用范围。
　　 研究方法：在近1年时间里，连续入组临床诊断DMD/BMD患者50名（男性48人，女性2人），其中4名先证者的母亲作为无症状携带者纳入研究。亦有6名先证者已死亡（生前仅临床疑诊，未基因确诊）家系中的可疑无症状女性携带者纳入研究，总入组人数60人。所有入组患者此前未明确基因诊断。
　　 入组受试者在targeted capture NGS平台进行全面基因检测，包括CNV和SNV。
　　 结果：
　　 ①50名受检患者中，共47人发现DMD基因致病突变，其中男性CNV7例、女性杂合CNV1例、男性SNV38例、女性杂合SNV1例。3人未检出致病突变，经肌肉活检免疫组化染色，其中1例证实为DMD，2例排除DMD。
　　 ②4名先证者母亲均证实为相同突变的杂合携带者。6名无先证者家系可疑携带者中，3人发现为杂合大片段缺失携带者，3人未发现致病突变。
　　 ③所有SNV均经Sanger测序证实，部分CNV重复MLPA证实。
　　 ④首次系统报道了外显子部分缺失这一新突变亚型，共发现4个家系。
　　 结论：
　　 1、 Targeted capture NGS检测平台适用于DMD/BMD临床基因诊断，可一次性全面准确检测致病突变。具有准确、高效的特点。
　　 2、外显子部分缺失是一种新突变亚型，影响临床表型及未来的基因治疗。

目录

中英文缩略词表

第一部分 基于目标序列捕获和高通量测序的DMD基因微小突变检测

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 基于目标序列捕获和高通量测序的DMD基因大片段缺失或重复检测

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 DUCHENNE/BECKER型肌营养不良全新基因诊断平台的建立及临床应用中新突变类型的发现

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述一 Duchenne型肌营养不良分子发病机制及基因治疗新进展

综述二 从后基因组时代的新视角重新审视神经系统疾病

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