起博电流及HCN通道在心房颤动的机制研究及伊伐布雷定对心房颤动的干预研究

摘要

第一部分、转基因心房颤动小鼠和野生型小鼠心房肌细胞的电生理学比较
　　目的：心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常之一，其发病机制复杂多样，目前尚无确定的阐明其病理生理机制，本研究采用自发性房颤转基因小鼠模型，研究小鼠心房肌细胞相关离子通道电流的改变，为进一步阐明房颤的发病机制提供理论基础。
　　方法：本研究实验组为自发性房颤转基因小鼠模型，对照组为同龄野生型普通C57BL/6小鼠;采用VisualSonics Vevo770高分辨率小动物超声系统对小鼠行心脏超声检测;采用PCLAB-UE生物信号采集处理系统记录小鼠的心电图数据;采用改良的Langendorff灌流装置、二步消化法来急性分离小鼠心房肌细胞;采用标准的全细胞膜片钳技术记录动作电位和离子通道电流（瞬时外向钾电流Ito、内向整流钾通道IK1和起搏电流If）。
　　结果：心脏超声数据显示，野生型小鼠和转基因小鼠的心脏结构和功能未见统计学差异。体表心电图数据显示，相比于野生型小鼠，转基因小鼠基础心率偏慢（转基因小鼠:391±61次/分;野生型小鼠:436±50次/分，p=0.048），转基因小鼠QT间期较野生型小鼠的偏长（42.3±8.6ms比34.2±8.6ms，p=0.02），但用心率校正后得到QTc，二者无统计学差异（34±6.8ms比29.1±7.1ms，p=0.076）。膜片钳记录结果显示，转基因小鼠和野生型小鼠的单个心房肌细胞动作电位AP近似于三角形，其复极较快，二者静息电位未见明显差异（转基因小鼠:-67.9±5.0mV;野生型小鼠-65.3±4.2mV，p=0.350），APD未见明显差异（59.1±14.3ms比46.0±12ms，p=0.082），其中APD20（4.8±0.5ms比4.9±0.8ms，p=0.837）、APD50(7.3±4.6ms比9.6±4.5ms，p=0.370)、APD90（29.2±8.8ms比25.6±8.2ms，p=0.437）比较均未见统计学差异。
　　在离子通道电流方面:Ito电流，转基因小鼠的峰值较野生型小鼠的峰值稍低，从-30mV～+70mV二者电流密度均有统计学差异，在70mV的电流密度（野生型小鼠:12.2±0.6pA/pF;转基因小鼠11.0±0.7pA/pF，p=0.036），但在通道动力学方面，即稳态启动曲线在二者并无差异;IK1电流，野生型小鼠和转基因小鼠心房肌细胞的未见明显差异;If电流，转基因小鼠的电流峰值较野生型小鼠的电流幅度明显增大，尾电流（-40mV引出）也明显增大，从-70mV～-170mV二者电流密度均有统计学差异，在-170mV的电流密度（野生型小鼠:-26.9±3.0pA/pF;转基因小鼠:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），转基因小鼠的稳态激活曲线明显右移，Boltzmann方程拟合得到半激活电压(V1/2)和斜率因子k，野生型小鼠V1/2为-128.2±1.65mV，而转基因小鼠为-109.45±1.35mV(p＜0.05)，野生型和转基因小鼠的k分别为13.91±0.98mV和14.41±0.78mV(p=0.58)。
　　结论：转基因房颤小鼠和野生型小鼠相比，二者的心脏结构和功能无明显差异;转基因房颤小鼠比野生型小鼠的心率稍慢，相应的QT间期略长，但经心率校正后的QTc在二者间并无差异;转基因房颤小鼠和野生型小鼠的心房肌细胞的电生理特性即动作电位的特点未发现明显差异;离子通道电流方面，转基因房颤小鼠心房肌细胞的It0电流较野生型小鼠的略减弱，但通道动力学方面并无差异;IK1电流在二者的心房肌细胞中无差异;转基因房颤小鼠心房肌细胞的If电流密度明显大于野生型小鼠，且心房肌细胞的If电流更容易激活，提示起搏电流可能参与了房颤的某种发生机制。
　　第二部分、转基因心房颤动小鼠和野生型小鼠心房肌电流改变的分子机制比较
　　目的：心房颤动（简称房颤）的电生理特性改变的基础在于心房肌细胞的离子通道改变，离子通道蛋白是房颤的关键分子底物。本研究采用自发性房颤转基因小鼠模型，研究小鼠心房肌组织相关离子通道表达的改变，为阐明房颤的发病机制提供理论基础。
　　方法：本研究实验组为自发性房颤转基因小鼠模型，对照组为同龄野生型普通C57BL/6小鼠;采用RT-PCR方法检测小鼠心房肌组织HCN通道mRNA(HCN2和HCN4)改变情况;采用Western-Blot方法检测小鼠心房肌组织HCN通道蛋白（HCN2和HCN4）及Kv4蛋白（Kv4.2和Kv4.3）的改变情况。
　　结果：转基因房颤小鼠心房肌组织的HCN2 mRNA相对表达(HCN2/GAPDH)明显高于野生型小鼠（1.10±0.40，N=6比0.36±0.17，N=6，p＜0.01）;同样，HCN4 mRNA的在转基因小鼠的心房肌组织中表达显著高于野生型小鼠（1.48±0.63，N=6比0.52±0.11，N=6，p＜0.01）;WB结果显示HCN2蛋白在野生型小鼠和转基因小鼠心房肌组织中差异不明显，而HCN4蛋白在转基因小鼠中表达明显高于野生型普通小鼠，经过蛋白条带灰度值分析，得出转基因小鼠心房肌组织HCN2的相对表达量为0.034±0.010，野生型小鼠为0.035±0.017(p=1.00); HCN4蛋白的相对表达量二者中有显著统计学差异（0.088±0.054比0.014±0.009，p=0.029）。Kv4.2和Kv4.3在野生型小鼠的表达明显高于转基因小鼠，Kv4.2蛋白在野生型小鼠心房肌组织中的表达明显高于转基因小鼠（0.68±0.26比0.27±0.22，N=6，p=0.015），同样，Kv4.3蛋白在野生型小鼠心房肌组织中的表达亦明显高于转基因小鼠(1.04±0.13比0.23±0.08，N=6，p=0.002)。
　　结论：转基因房颤小鼠心房肌组织的HCN2和HCN4 mRNA相对表达显著高于野生型小鼠;转基因小鼠心房肌组织的HCN4蛋白水平相对表达显著高于野生型小鼠;转基因小鼠心房肌组织的Kv4.2和Kv4.3蛋白水平相对表达显著低于野生型小鼠。
　　第三部分、伊伐布雷定对心房颤动的预防作用及对起搏电流和HCN通道的影响
　　目的：近年来的研究发现起搏电流参与了房颤的发生发展病理生理机制，作为起搏电流的特异性阻滞剂一伊伐布雷定，目前被证实通过抑制起搏电流进而减少某些心律失常的发生，本研究拟探讨伊伐布雷定在心房颤动的预防和治疗方面的作用以及对起搏电流及HCN通道的影响，为房颤的发病机制和防治打下理论基础。
　　方法：本研究将5-6月龄大小、尚未发生房颤的转基因小鼠随机分为用药组（15只）和对照组（15只），同龄的野生型C57B1/6小鼠也随机分为用药组（15只）和对照组（15只）;将伊伐布雷定（7mg/kg/天，加入饮用水）喂养用药组小鼠，持续时间为4个月，平均每2周行心电监测，观察心率变化情况及房颤的发生情况。
　　本研究采用改良的Langendorff灌流装置、二步消化法来急性分离小鼠心房肌细胞;采用VisualSonics Vevo770高分辨率小动物超声系统对小鼠行心脏超声检测;采用PCLAB-UE生物信号采集处理系统记录小鼠的心电图数据;采用标准的全细胞膜片钳技术记录动作电位和离子通道电流;本研究采用RT-PCR方法检测小鼠心房肌组织HCN通道改变情况;采用Western-Blot方法检测小鼠心房肌组织HCN通道蛋白改变情况。
　　结果：经过4个月的伊伐布雷定治疗后，转基因用药组小鼠阵发性房颤的发生率对照组小鼠明显降低（用药组:41％比对照组:16.7％，p＜0.01），野生型小鼠未记录到房颤发作。在体表心电数据方面，转基因用药组小鼠心率较对照组下降了约13％（用药组:392±61;对照组:342±57次/分，p=0.042），对应的QT间期和心率校正后的QT间期(QTc)均无统计学差异;野生型用药组小鼠较对照组下降了约11％（用药组436±51次/分比对照组:387±32次/分，p=0.044），其对应的QT间期有所延长，但QTc无明显差异。在心脏超声数据方面，转基因用药组小鼠左室收缩末期内径较对照组小鼠有所缩短，射血分数和缩短分数均有增加;野生型小鼠用药组和对照组数据未见明显统计学差异。膜片钳单细胞动作电位记录方面，转基因用药组小鼠和对照组小鼠心房肌细胞静息电位、APD20、APD50及APD90差异均无统计学意义;同样，野生型用药组小鼠和对照组小鼠心房肌细胞上述指标亦均无统计学差异。在起搏电流记录方面，转基因用药组小鼠心房肌起搏电流引出率较对照组明显减低（46.7％比75.4％，p＜0.01），野生型用药组小鼠和对照组未见差异(43.3％比49.2％，p=0.78);转基因小鼠用药组和对照组起搏电流比较，用药组小鼠的电流幅度较对照组小鼠的电流幅度明显减弱，尾电流也明显减小，用药组小鼠的I-V曲线明显上移，从-80mV～-170mV二者电流密度均有统计学差异（在-170mV的电流密度，用药组:-17.7±3.0pA/pF，对照组:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），用药组小鼠的稳态激活曲线明显左移，二者的半激活电压(V1/2)（用药组:-124.4±3.25mV，对照组:-109.45±0.72mV，p＜0.001）和斜率因子k(22.58±2.75mV比14.40±0.78mV，p＜0.001)均有显著统计学差异。分子生物学方面，伊伐布雷定应用后使得转基因用药组小鼠心房肌HCN2 mRNA相对表达下降了50％(用药组:0.55±0.34比对照组:1.10±0.40，p=0.029)，同样HCN4mRNA相对表达量下降了约63.5％(0.54±0.41比1.48±0.63，p=0.012);在野生型小鼠中用药组和对照组心房肌组织的HCN2和HCN4 mRNA相对表达量均未见明显统计学差异。在应用伊伐布雷定口服治疗4个月后，转基因用药组小鼠和野生型用药组小鼠心房肌组织HCN2(0.02±0.0078比0.0097±0.006)及HCN4蛋白相对表达量(0.18±0.10比0.22±0.15)差异亦未见统计学意义。
　　结论：长期伊伐布雷定治疗能显著降低尚未进展为房颤的转基因房小鼠的房颤发生率，对房颤的发生有一定的预防作用;伊伐布雷定治疗能逆转转基因房颤小鼠的心脏电生理改变，这主要是降低了起搏电流的“功能获得”作用，进而减弱了其自发性电活动而起到抗心律失常作用;伊伐布雷定的抗心律失常作用不依赖于其降低心率的作用，主要可能是由于其抵消了转基因小鼠的HCN通道超表达，逆转了转基因小鼠心房肌的结构改变;此外，长期的伊伐布雷定治疗并不影响小鼠的QTc间期，提示伊伐布雷定具有良好的安全性;长期的伊伐布雷定治疗后，用药组小鼠的射血分数及缩短分数较对照组显著增大，提示伊伐布雷定对于心肌收缩力的增强也有一定的作用。

目录

缩略词表

摘要

第一部分 转基因心房颤动小鼠和野生型小鼠心房肌细胞的电生理学比较

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 转基因心房颤动小鼠和野生型小鼠心房肌电流改变的分子机制比较

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 伊伐布雷定对心房颤动的预防作用及对起搏电流和HCN通道的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 起搏电流和心房颤动关系的研究进展

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