H5N1型禽流感病毒和纳米材料引起急性肺损伤的机制研究和防治药物筛选

摘要

H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤的致病机理研究和防治药物筛选自2003年发现H5N1型高致病性禽流感病毒能够感染人体以来，经WHO统计，截至目前全世界范围内共有784人感染H5N1病毒，其中429人死亡，整体死亡率高达54.7％。加之相关研究报道已证实，H5N1病毒仅需在HA蛋白和PB2蛋白上的数个氨基酸突变即可通过空气在雪貂之间传播。面对H5N1病毒居高不下的死亡率和为数不多的可供选择的药物，我们将研究重点集中于H5N1型禽流感病毒的致病机理解析和发现新的可用于治疗H5N1病毒感染的药物和方法。
　　我们的前期研究发现了肾素-血管紧张素系统在H5N1病毒感染导致的急性肺损伤中发挥重要功能，RAS效应分子AngⅡ被上调且介导急性肺损伤，而AngⅡ负向调控蛋白ACE2则具有保护功能，且可通过预防联合治疗性给药缓解小鼠急性肺损伤症状并挽救小鼠死亡。在本项目中，我们进一步发现，H5N1型高致病性禽流感病毒感染人体后同样会引起AngⅡ的显著上调，并通过检测H5N1病毒感染后连续时间点AngⅡ表达水平证明，其整体表达水平，变化趋势和最终浓度可能作为反应H5N1病毒感染患者最终是否致死的重要指标之一。而ACE2蛋白的保护机制则可能包括降低AngⅡ的表达，抑制病毒复制并降低病毒载量等。
　　进一步，根据老药新用的理念，我们对一系列临床使用药物在H5N1病毒感染动物模型上进行了治疗效果的尝试，发现临床抗疟疾药物氯喹和临床降压药氯沙坦可分别通过不同的机制来缓解H5N1病毒引起的急性肺损伤症状，但ACEi类药物和他汀类药物经检测后并不具有明显的治疗效果。上述研究提供了多种可用于治疗H5N1病毒感染的临床候选药物。
　　氧化铜纳米颗粒可引起A549细胞自噬性细胞死亡金属氧化物纳米颗粒已被用于酶催化，环境检测和个人护理产品等多个领域，是目前应用最广泛的一类纳米颗粒。我们之前对部分常见的金属氧化物纳米颗粒如二氧化硅，二氧化钛，氧化铜，四氧化三铁等对呼吸道细胞毒性研究发现，仅氧化铜纳米颗粒可引起呼吸道细胞显著的细胞死亡。
　　在本课题中，我们又进一步地对氧化铜纳米颗粒引起细胞死亡的种类和机制进行探索，通过电镜观察自噬小泡，confocal观察LC3蛋白聚集的细胞数量及加入巴佛洛霉素A1药物观察自噬潮等指标，我们发现其能够引起细胞产生严重的自噬现象，进一步通过siRNA或自噬抑制剂进行作用后，氧化铜纳米颗粒引起的细胞死亡得到显著缓解，证明氧化铜纳米颗粒可以引起呼吸道细胞的自噬性死亡。

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摘要

英文略语表

序言

第一部 分H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究和临床防治药物的筛选

第一节 RAS系统在H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤过程中的研究

前言

1．实验材料

2．主要实验设备

3．主要溶液配置

4．实验方法

5．实验结果

6．实验结论

7．讨论

第二节 H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤的候选临床治疗药物筛选

前言

1．实验材料

2．主要实验设备

3．主要溶液配置

4．实验方法

5．实验结果

6．结论

7．讨论

第二部分 氧化铜(CuO)纳米颗粒可引起A549细胞产生自噬性的细胞死亡

前言

1．实验材料

1．1．实验试剂

1．2．主要生化试剂和抗体

1．3．细胞培养及转染试剂

1．4．纳米颗粒和药物

2．主要实验设备

3．主要溶液配置

3．1．细胞冻存液的配制

3．2．电镜样品固定液的配置

3．3．常用缓冲液的配置

3．4．细胞裂解液的配制

3．5．SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制

4．实验方法

4．1．氧化铜纳米颗粒感染A549细胞后细胞活力检测

4．2．氧化铜纳米颗粒感染A549细胞电镜观察

4．3．氧化铜纳米颗粒感染A549细胞荧光共聚焦显微镜观察

4．4．氧化铜纳米颗粒引起A549细胞自噬潮现象检测

4．5．Atg 5基因siRNA转染实验

5．实验结果

5．1．氧化铜纳米颗粒可导致A549细胞死亡且呈梯度效应

5．2．氧化铜纳米颗粒可增加A549细胞中的自噬小泡

5．3．氧化铜纳米颗粒可促进LC3蛋白聚集

5．4．氧化铜纳米颗粒可引起自噬潮

5．5．敲低Atg 5基因可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡

5．6．敲低Atg 5基因可降低细胞自噬程度

5．7．敲低Atg 5基因可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡

5．8．自噬抑制剂可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡

6．结论

7．讨论

参考文献

综述 用于治疗流感病毒感染引发疾病的策略和相关药物

致谢

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