LHRH-TAT-壳聚糖/siRNA复合物与巨噬细胞的相互作用以及TPP-LHRH-MPG△NLS/AFP-siRNA复合物对肿瘤生长的影响

摘要

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是普遍存在于真核生物体内的一种能够对特定的mRNA序列进行降解的转录后调控机制。在包括肝癌在内的多种癌症疾病的治疗研究中具有良好的应用前景。然而，由于RNA本身具有的易降解、不易穿过细胞膜等特点，为RNAi的临床应用制造了很大的阻碍。新型基因载体能够提高RNA的递送效率，但其生物相容性、RNA释放以及对RNAi效率的影响需要更加深入的评估。
　　生物相容性是评价非病毒载体与机体相互作用的一个指标，载体与免疫系统的相互作用不仅反映了免疫系统对载体的应答情况，也是衡量载体是否对人体组织损伤程度的一个指标。
　　本文以不同N/P比（1∶2、1∶1、2∶1、5∶1和10∶1）使LHRH-TAT-壳聚糖（LHRH-TAT-chitosan，TLC）以及未进行任何修饰的低分子量壳聚糖（low molecular weight chitosan，LMWC）包裹siRNA后形成TLC/siRNA纳米复合体。与未进行任何修饰的壳聚糖相比，TLC具有更好的siRNA结合能力。以不同N/P(10∶1、20∶1)与siRNA形成纳米复合体后，其粒径分布于90-150 nm，zeta电位稳定在+2.7-+19.3 mV。体内与体外的巨噬细胞吞噬实验证明，相比LWMC/siRNA复合物而言，含200 nmol/L siRNA的TLC/siRNA纳米复合物在24 h内未引起上述细胞因子的明显释放，TLC/siRNA纳米复合物被巨噬细胞摄入量更高，但两者均未对吞噬活性和细胞因子生成产生明显影响。因此，TLC无明显免疫毒性，是一种有应用前景的siRNA载体。
　　研究人员曾经利用三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphae，TPP)对壳聚糖、PEG等载体进行改性，从而提高了载体的药物运送效率。本文利用化学交联的方式，将TPP与LHTH-MPGΔNLs载体的氨基酸相连接，制成新型TPP-LHRH-MPGΔNLS载体，并包裹AFP-siRNA。与未进行TPP修饰的LHRH-MPGΔ NLS/APF-siRNA纳米复合体相比，TPP-LHRH-MPGΔNLs/APF-siRNA纳米复合体的zeta电位变高，在对肿瘤细胞的生长抑制实验中，TPP-LHRH-MPGΔNLs/APF-siRNA纳米复合体于转染后48 h开始对HepG2，Bel7402两种肝癌细胞的成活率有明显影响，而TPP-LHRH-MPGΔNLs/APF-siRNA纳米复合体作用下的肝癌细胞的成活率略低于未修饰TPP的纳米复合体。RT-PCR对AFP基因的抑制效果进行了检测，结果表明，相对Bel7402细胞，TPP-LHRH-MPGΔ NLS/APF-siRNA纳米复合体对HepG2细胞的作用不强，且TPP的连接会影响载体的靶向性。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．RNA干扰的发展

2．RNA干扰的作用机制

3．RNA干扰的应用

3．1 RNA干扰在基因功能研究中的应用

3．2 RNA干扰在植物抗病毒研究中的应用

3．3 RNA干扰在临床治疗中的应用

4．提高RNA干扰效率的策略及非病毒载体的开发

4．1 siRNA的化学修饰

4．2 RNA的体内运输及相关非病毒载体

5．负载基因的纳米复合体进行基因转染的障碍

5．1 纳米复合体与免疫系统的相互作用

5．2 纳米复合体与细胞的相互作用

6．TPP对非病毒载体的修饰

7．课题的提出

第二章 LHRH-TAT-壳聚糖／siRNA纳米复合物与免疫系统的相互作用

1．试剂与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 试剂配制

2．实验步骤

2．1 纳米复合物的制备

2．2 凝胶阻滞实验

2．3 纳米复合物表征

2．4 细胞因子的测定

2．5 巨噬细胞吞噬实验

2．6 巨噬细胞对纳米复合物的摄取

2．7 统计学方法

3．实验结果

3．1 纳米复合物的表征

3．2 纳米复合物对细胞因子释放的影响

3．3 纳米复合物对小鼠体内巨噬细胞活性的影响

3．4 纳米复合物体外对巨噬细胞活性的影响

4．讨论

第三章 TPP修饰LHRH-MPG△NLS对肿瘤细胞生长的影响

1．试剂与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验设备

1．3 试剂配制

实验步骤

2．1 TPP修饰LHRH-MPG△NLS的表征

2．2 TPP-LHRH-MPG△NLS／AFP-siRNA对肿瘤细胞生长的影响

2．3 TPP-LHRH-MPG△NLS／AFP-siRNA对靶基因的抑制作用

3．实验结果

3．1 TPP-LHRH-MPG△NLS／siRNA的表征

3．2 TPP-LHRH-MPG△NLS／AFP-siRNA对肿瘤的抑制效率

3．3 TPP-LHRH-MPG△NLS／AFP-siRNA对目的基因的抑制效率

4．讨论

总结与展望

参考文献

致谢

附录