H7N90甲型流感病毒神经氨酸酶抑制剂评价模型的建立及新型神经氨酸酶抑制剂的发现

摘要

神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)以四聚体形式嵌在流感病毒表面，是重要的功能蛋白，可切割唾液酸(Sialic acid，SA)促进子代病毒的释放，是抗流感病毒药物的重要靶点。现有以NA为靶点的药物均是SA类似物，通过竞争结合病毒表面NA而抑制其活性，进而阻断子代病毒的释放。
　　甲型H7N9流感病毒[A/Hangzhou/1/2013(H7N9)，简称H7N9]是首个确认的可感染人的H7N9毒株，于2013被分离发现，本研究以其神经氨酸酶为研究对象，建立了野生NA酶水平药物评价模型，并比较了扎那米韦和奥司他韦对此株病毒与H1N1、H3N2和H5N1的药效学。流感病毒耐药是治疗病毒性流感的难点，确认药物对突变病毒的敏感性有助于临床用药。达菲是抗流感病毒的储备药，临床出现的达菲耐药病毒最常见突变位点是H274Y和R292K（根据N2亚型序列确定编号）。据此，本研究建立了NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K酶活性评价模型，并应用模型检测了扎那米韦和奥司他韦药效学。此外，在实验室前期工作基础上，本研究重复了以流感病毒[A/California/04/2009(H1N1)，简称CA/04]和[A/Puerto Rico/8/34/MountSinai(H1N1)，简称PR/8]神经氨酸酶为靶点的野生酶水平药物评价模型，并在获得流感病毒[A/Wyoming/03/2003(H3N2)，简称WY/N2]、[A/W SN/1933(H1N1)，简称WS/33]和[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)，简称VN/04]神经氨酸酶质粒的基础上，完善了这些毒株的野生NA酶水平药物评价模型。
　　模型经阳性药验证，结果显示扎那米韦对神经氨酸酶的半数抑制浓度(The halfmaximal inhibitory concentration， IC50)分别为NAH7N9-WT:1.1±0.1 nmol·L-1;NAH7N9-H271Y:1.4±0.2 nmol·L-1;NAH7N9-R289K:38.0±5.9 nmol·L-1; NACA/04-WT:0.3±0.1nmol·L-1; NAPR/8-WT:0.3±0.1 nmol·L-1; NAWY/N2-WT:1.1±0.4nmol·L-1; NAWS/33-WT:0.4±0.1 nmol·L-1; NAVA/04-WT:0.8±0.1 nmol· L-1;奥司他韦羧酸盐对神经氨酸酶的IC50分别为NAH7N9-WT:1.6±0.6 nmol·L-1; NAH7N9-H271Y:15.1±2.6 nmol·L-1;NAH7N9-R289K:大于1000.0 nmol·L-1。结果表明:(1)扎那米韦对NAH7N9-WT的抑制活性与其他毒株相当，提示该药物能有效抑制野生H7N9流感病毒，可用于治疗携带该病毒的病人;(2) NAH7N9-R289K病毒对扎那米韦和奥司他韦均耐药，耐药倍数分别为34倍和大于625倍，提示当病人感染该突变病毒时建议停止使用这2种药物;(3)NAH7N9-H271Y病毒对扎那米韦和奥司他韦均不耐药，提示临床出现该突变毒株的可能性较小。
　　唾液酸类似物结构特征的神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase Inhibitor，NAI)是临床一线抗流感病毒药物，其缺点是容易产生耐药病毒和引起较严重神经精神异常副作用(Neuropsychiatric Adverse Events，NPAEs)。流感病毒为RNA病毒，基因在复制过程中易发生突变，在药物存在下，产生耐药突变的病毒可存活并繁殖。由于现有NAI均是唾液酸类似物，导致NA耐药突变位点相似，临床表现为交叉耐药及多药耐药性。NA在生物中广泛存在，人体内不同组织和器官中也存在着组成性的神经氨酸酶家族。扎那米韦和奥司他韦等作为SA类似物也可与人体组成性NA结合并抑制其活性，影响其正常生理功能，产生药物副作用，临床表现为幻觉、行为异常、惊厥和精神错乱等，降低患者生活质量。因此，出于减少耐药和避免NPAEs双重考虑，寻找非底物类似物的神经氨酸酶抑制剂具有重要意义。
　　本研究以成药库为基础寻找新型非SA类似物的神经氨酸酶抑制剂。首先应用野生高致病流感毒株[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)]NA酶学模型评价了1600个上市药物，获得药物终浓度为10-4 mol·L-1，抑制率≥60％的活性化合物40个。然后综合这些药物原适应症、作用靶点、机制、副作用以及血药浓度等信息，从中挑出12个药物，评价了它们对NAPR/8-WT的影响，最终得到4个较优药物:利福平、盐酸非那吡啶、柳氮磺胺吡啶和原卟啉Ⅸ。结果显示它们对NAH7N9-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、90.6μmol· L-1（盐酸非那吡啶）、77.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和38.6μmol· L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAH7N9-H271Y的IC50分别为大于100μmol-L-1（利福平）、大于100μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、88.5μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和大于100μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAH7N9-R289K的IC50分别为99.8μmol·L-1（利福平）、91.4μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、57.8μmol· L-1（柳氮磺胺吡啶）和61.0μmol-L。1（原卟啉Ⅸ）;对NACA/04-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、94.3μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、97.5μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和54.5μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAPR/8-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、大于100μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、90.8μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和43.0μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAWY/N2-WT的IC50分别为大于100μmol-L-1（利福平）、69.7μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、85.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和69.9μmol·L-1(原卟啉Ⅸ）;对NAWS/33-WT的IC50分别为98.7μmol·L-1（利福平）、94.4μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、75.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和51.2μmol· L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAVN/04-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、90.8μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、86.8μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和54.8μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）。
　　本论文还评价了天然产物单体、化学合成或生物合成来源的小分子化合物236个，结果发现了1个活性化合物(WB813)，其对神经氨酸酶的半数抑制浓度分别为:NACA/04-WT:15.6μmol·L-1; NAP/8-WT:58.0μmol·L-1; NAWY/N2-WT:6.3μmol·L-1;NAWS/33-WT:66.9μmol·L-1; NAVN/04-WT:13.2μmol·L-1，对NAH7N9-WT、NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K抑制活性较低，IC50均大于100μmol·L-1。
　　综上所述，本论文首先构建了2013年人感染H7N9流感毒株野生NA酶水平药物评价模型，然后预测并建立了两种奥司他韦耐药型突变NA酶活性评价模型，研究结果可为临床治疗携带野生或突变H7N9病毒的病人提供参考。本研究还重复和完善了以其他株甲型流感病毒NA为靶点的酶水平药物评价模型，应用模型对包含1600个上市药物的成药库和236个小分子化合物进行筛选，最后得到了5个活性化合物，值得注意的是其中4个化合物都不是SA类似物，为新型NAI的设计和寻找提供思路。

目录

摘要

前言

1 流感流行

2 神经氨酸酶与血凝素蛋白

3 神经氨酸酶抑制剂及其耐药

4 神经氨酸酶抑制剂的副作用

5 神经氨酸酶抑制剂评价模型

6 人感染H7N9甲型流感病毒

实验材料

1 细胞和感受态细菌

2 质粒和病毒

3 引物合成与测序

4 阳性药物和化合物

5 抗体

6 试剂

7 仪器

8 耗材

实验方法

1 相关分子生物学实验技术

2 细胞培养

3 构建突变型NA质粒

4 建立NA酶学水平模型

5 数据处理

实验结果

1 流感病毒神经氨酸酶酶学水平药物评价模型的建立

2 从小分子化合物中筛选NAI

3 以成药库为基础筛选NAI

讨论

1 H7N9流感病毒未出现NAH274Y突变的原因

2 应用DS软件研究活性化合物与NA结合模式

结论

总结

附图和附表

参考文献

缩写对照表

致谢

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