抗VEGF与IL-10主动免疫对HPV感染肿瘤模型的作用及碳、氮源对酵母高密度发酵与不同启动子指导的HPV16 L1表达的影响

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 抗VEGF与IL-10主动免疫对HPV感染肿瘤模型的作用
　　肿瘤免疫抑制微环境显著抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤的发生发展，并阻碍肿瘤免疫治疗取得疗效。IL-10是重要的免疫抑制分子，可显著抑制细胞毒T淋巴细胞(CTLs)与Th1细胞等免疫效应细胞的功能、从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。血管内皮生长因子(VEGF)可促进肿瘤血管的形成，提高血管通透性，刺激肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，从而促进肿瘤生长与转移。此外，VEGF刺激的肿瘤血管异常造成肿瘤组织缺氧，诱导免疫抑制细胞产生，是肿瘤免疫抑制微环境形成的重要促因。
　　目的：
　　本研究旨在利用疫苗主动免疫方式，诱导持续存在的针对VEGF和IL-10的特异性抗体，以阻碍其免疫抑制及促肿瘤生长作用，从而评价抗细胞因子疫苗策略调控肿瘤免疫抑制微环境、促进抗肿瘤免疫的潜能。
　　方法：
　　经生物信息学分析确定两个小鼠IL-10抗原肽片段（A肽与F肽）及一个小鼠VEGF表位，并以化学合成制备，通过化学偶联到构建的表面呈现三个赖氨酸(K)的重组HBcAg病毒样颗粒(HBcAg-KKK)表面。同时，也将小鼠VEGF表位重组于HBcAg优势抗原表位，形成嵌合蛋白。此外，还构建了重组的硫氧还蛋白-IL10的融合蛋白。将获得的候选疫苗混合弗氏佐剂后皮下免疫C57小鼠，以ELISA检测特异抗体水平。小鼠随后皮下接种TC-1肿瘤细胞。考察小鼠肿瘤动态生长情况，在实验终点牺牲小鼠，称量肿瘤体积，并分离肿瘤浸润淋巴细胞与脾细胞、以ELISPOT分析肿瘤特异的IFN-γ表达的淋巴细胞水平、以流式细胞术分析Th2的应答，以ELISA分析血液中IFN-γ细胞因子水平，此外，以H&E染色进行肿瘤的组织学分析。
　　结果：
　　经化学偶联及基因重组成功构建了抗IL-10与VEGF的VLPs疫苗，免疫小鼠获得了特异性的抗体应答，预防性的抗IL-10与VEGF主动免疫抑制了移植肿瘤TC-1的生长，与模型小鼠及载体免疫对照组小鼠相比较，HBcAg-VEGF及HBcAg-KKK-IL-10/A和HBcAg-KKK-IL-10/F免疫的小鼠具有增强的肿瘤抗原特异的IFN-γ表达细胞水平、升高的血清IFN-γ浓度，降低的Th2水平以及减少的肿瘤血管增生。
　　结论：
　　靶向IL-10与VEGF的疫苗主动免疫具有下调肿瘤免疫抑制微环境、促进肿瘤特异细胞免疫应答及促肿瘤杀伤的潜能，有希望成为肿瘤免疫治疗的有效手段。
　　第二部分 碳、氮源对酵母高密度发酵及不同启动子指导的HPV16 L1表达的影响
　　HPV感染引起的宫颈癌等癌症及癌前病变是威胁人类健康的重要问题。尽管目前已有HPV疫苗上市，但价格昂贵，且由于HPV基因型间缺乏交叉保护，多价疫苗成为必要，更需要降低疫苗成本以促进其应用推广。因此，疫苗制备技术仍待大力提升。
　　目的：
　　本课题旨在探讨不同碳氮源对于毕赤酵母高密度生长的影响，以及对甲醇氧化酶1(AOX1)启动子、翻译延伸因子-1（TEF-1）启动子和甲醛脱氢酶(FLD)启动子指导下HPV16_L1蛋白产量的影响，旨在为HPV疫苗的低成本及方便生产提供一个可供选择的有效方案。
　　方法：
　　使用甘油、甲醇、葡萄糖、山梨醇四种碳源以及甲胺、硫酸铵两种不同碳源在生物反应器中进行重组毕赤酵母的高密度发酵以及诱导（AOX1与FLD启动子）或组成型（TEF-1启动子）表达HPV16_L1蛋白。根据溶氧(D0)曲线变化控制碳源的流加时间和流速。每隔3h取样一次，发酵一定时间后收集发酵液，检测菌液的OD600与菌体湿重;以Western blot动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平;以POROS501+S阳离子交换层析摸索高密度发酵所得HPV16L1蛋白的纯化。
　　结果：
　　在利用组成型的PTEF-1的重组菌中，以甘油作为碳源，菌体细胞湿重可达到510g/L，HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右，甲醇利用下HPV L1蛋白在144小时后仍保持较高水平表达，葡萄糖中60小时HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上，甘油作为碳源在72小时左右可获得最高的目的蛋白收获总量。在利用PFLD的重组菌中，在甲醇+甲胺、甲醇+硫酸铵、甘油+甲胺、甘油+硫酸铵组合中，菌体湿重分别能够达到320 g/L、300g/L、430g/L和400g/L，在菌体生长总量上甘油+甲胺最高，但在蛋白表达量上甲醇+硫酸铵最高。在利用PAOX1的重组菌中，毕赤酵母利用甘油生长，并在甲醇诱导下，菌体湿重能达到417 g/L。发酵菌体纯化后，在电镜下观察到病毒样颗粒存在。
　　结论：
　　毕赤酵母菌生长速率与不同启动子指导下的HPV L1表达受不同碳氮源组合的显著影响，寻找最佳的菌体增长与目的蛋白表达平衡点，对于简化生产、降低疫苗成本具有重要意义。

目录

第一部分 抗VEGF与IL-10主动免疫对HPV感染肿瘤模型的作用

摘要

第一章 前言

1．1 肿瘤微环境

1．2 IL-10功能及其在肿瘤免疫抑制微环境中的作用

1．3 VEGF功能及其在肿瘤免疫抑制微环境中的作用

1．4 本课题研究思路、目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．4 构建重组表达质粒HBcAg-KKK、HBcAg—VEGF

2．5 构建表达重组硫氧还蛋白融合蛋白Trx-IL10的质粒

2．6 重组质粒的诱导表达及可溶性鉴定

2．7 病毒样颗粒的纯化

2．8 病毒样颗粒的鉴定

2．9 蛋白浓度测定

2．10 Trx-IL10样品的表达及纯化

2．11 Western检测目的蛋白

2．12 抗原肽与病毒样颗粒的化学偶联

2．13 TC-1肿瘤细胞培养

2．14 小鼠预防性免疫实验

2．15 小鼠移植肿瘤模型的建立

2．16 预防性实验效果评价

第三章 实验结果

3．1 酶切鉴定重组质粒

3．2 重组蛋白进行诱导表达并鉴定可溶性

3．3 蛋白纯化

3．4 病毒样颗粒的鉴定

3．5 重组蛋白Trx-IL10进行Western blot鉴定与Q阴离子柱纯化

3．6 抗原肽与病毒样颗粒载体的化学偶联

3．7 疫苗免疫对Tc-1移植小鼠肿瘤生长的干预

第四章 讨论

4．1 靶向VEGF和IL-10的病毒样颗粒疫苗的构建

4．2 靶向VEGF和IL-10的疫苗免疫的效果评价

4．3 疫苗免疫抗肿瘤生长的效应机制评价

4．4 小鼠肿瘤病理切片评价

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

第二部分 碳、氮源对酵母高密度发酵及不同启动子指导的HPV16 L1表达的影响

摘要

第一章 前言

1．1 HPV及其引起的疾病

1．2 HPV相关疫苗的研究和发展

1．3 毕赤酵母表达系统

1．4 毕赤酵母启动子研究进展

1．5 本课题研究思路、目的及意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要仪器

2．3 常用试剂配制

2．4 实验方法

第三章 实验结果

3．1 具PTEF／HPV16 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳源生长增殖情况

3．2 不同碳源利用条件下PTEF指导的HPV16_L1蛋白表达率动态分析

3．3 不同碳源利用条件下PTEF指导的HPV16_L1蛋白总产量动态分析

3．4 具PFLD／HPV16 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳氮源的生长增殖情况

3．5 不同碳氮源组合下PFLD指导的HPV16_L1蛋白表达率动态分析

3．6 不同碳氮源组合下PFLD指导的HPV16_L1蛋白总产量动态分析

3．7 具PAOX1／HPV16 L1表达单元的毕赤酵母菌体生长增殖情况

3．8 Western blot分析甲醇诱导毕赤酵母PAOX1指导的HPV16_L1的表达

3．9 毕赤酵母在PAOX1指导下利用甲醇诱导的HPV16_L1蛋白的纯化

第四章 讨论

4．1 启动子PTEF指导下的HPV16L1蛋白表达

4．2 启动子PFLD指导下的HPV16L1蛋白表达

4．3 启动子PAOX1指导下的HPV16L1蛋白的表达与纯化

4．4 小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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