药物性肝损伤体外筛选模型和何首乌致肝损伤的初步研究

摘要

药物性肝损伤(Drug-induced liver injury, DILI)常常是药物研发失败、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此，无论是上市前还是上市后，对有肝损伤风险的药物，建立有效、灵敏、特异的体外DILI筛选模型显得尤为重要。
　　何首乌作为传统补益类中药的一种，使用十分广泛。药物不良反应数据显示，它具有明显的肝损伤风险。虽然国内外近年来进行了一些基础性研究，但毒性成分目前仍不清楚。因此，需要对何首乌致肝损伤毒性成分及其可能的作用机制进行研究。
　　首先，开展五种肝细胞体外模型的比较研究。选择对乙酰氨基酚、卡马西平、双氯芬酸钠、异烟肼、丙戊酸钠、盐酸胺碘酮、盐酸四环素、利福平、依托泊苷、盐酸拉贝洛尔、达那唑、雷公藤甲素、野百合碱和黄独素B共14个药物为DILI阳性对照，盐酸班布特罗、盐酸丁螺环酮和丁溴酸东莨菪碱共3个药物为DILI阴性对照，采用CCK-8细胞毒性筛选、高内涵筛选和肝相关生化指标筛选等方法，对L-02、HepG2、HepaRG和hiHeps等四种人源肝细胞系和一种原代大鼠肝细胞(Primary rat liver cells，PRLs)进行比较研究。结果表明，HepaRG肝细胞系鉴别DIIL药物的能力最高，并依鉴别DILI药物的能力将其排序为HepaRG＞L-02＞HepG2=hiHeps＞ PRLs。HepaRG肝细胞在检测氧化应激、线粒体损伤以及内质网应激等方面灵敏性较高，呈剂量依赖性，优于其他四种肝细胞。在相关性分析和显著性检验中，谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)、苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)可同时反映双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮和达那唑对HepaRG肝细胞的影响，提示可以作为探索DILI药物的肝损伤相关生物标志物。
　　其次，对何首乌致肝损伤成分进行研究。一方面，我们对何首乌药材进行提取和分离，得到何首乌70％总醇提物和8个提取组分;另一方面，选择易于获得的何首乌所含的16个单体成分作为研究对象。采用CCK-8细胞毒性筛选、UPLC-PAD含量测定以及肝相关生化指标测定等方法，对何首乌70％总醇提物、8个提取组分和16个单体成分进行毒性组分和毒性成分的研究。结果表明，第四组分(Fraction4,Fr.4)可能为何首乌致肝损伤的毒性组分，没食子酸、白藜芦醇、大黄素、大黄酸为何首乌中具有明显细胞毒性的单体成分。结合L-02肝细胞损伤特征分析和含量分析，推测没食子酸可能是何首乌致肝损伤的主要成分之一。此外，谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GLDH）和γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transferase，γ-GT)都反映何首乌70％总醇提物和没食子酸对肝细胞的损伤作用。
　　最后，对没食子酸致肝细胞损伤的初步机理进行研究。分别从细胞周期、细胞凋亡、高内涵筛选（活性氧、线粒体膜电位、内质网应激、中性脂代谢和钙离子稳态）、二维凝胶电泳技术结合分子生物学验证，探索没食子酸在不同剂量和不同时间下对HepaRG肝细胞损伤的机理。结果表明，没食子酸对HepaRG肝细胞的细胞周期没有显著影响;没食子酸呈剂量依赖性的诱导HepaRG肝细胞凋亡;没食子酸呈剂量依赖性和时间依赖性的诱导HepaRG肝细胞内质网应激、降低细胞内活性氧水平和钙离子浓度，对线粒体膜电位和中性脂代谢没有显著影响;没食子酸(0.5mM)在不同时间（24h和48h）处理HepaRG肝细胞，共筛选出11个差异蛋白，其中24h组有6个差异蛋白，48h组有5个差异蛋白。结合GO和Pathway分析，发现24h处理组主要集中在内质网中功能蛋白的折叠和加工方面，48h处理组主要集中在功能蛋白折叠加工、功能蛋白前体RNA核糖核酸的调控、炎症过程、宿主防御等方面;分子生物学验证结果表明肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-prolylcis-trans isomeraseA，PPIA)的蛋白表达一致性和基因水平表达的一致性，推测PPIA可能是没食子酸潜在的调控靶点。
　　HepaRG在鉴别DILI药物方面优于其他四种肝细胞(L-02、HepG2、hiHeps和PRLs肝细胞);AST、LDH和MDH可以作为在体外反映DILI药物肝损伤作用的潜在生物标志物。没食子酸可能为何首乌致肝损伤的主要成分之一，其机制可能是通过抑制PPIA的转录和翻译，引起功能蛋白的错误折叠和加工，造成内质网应激，进而导致肝细胞凋亡。

目录

摘要

Abbreviations

前言

第一章 药物性肝损伤体外模型的筛选

第一节 肝细胞的制备和培养

第二节 CCK-8细胞毒性筛选

第三节 高内涵筛选

第四节 肝相关生化指标筛选

讨论

结论

第二章 何首乌致肝损伤毒性成分韵筛选

第一节 何首乌70％总醇提物和8个组分韵制各以及16个单体成分韵购置

第二节 CCK-8细胞毒性筛选

第三节 大黄素、大黄酸、白藜芦醇和没食子酸的含量测定

第四节 肝相关生化指标筛选

讨论

结论

第三章 何首乌致肝损伤成分的作用机制研究

第一节 细胞周期检测

第二节 细胞凋亡柱潮

第三节 高内涵筛选

第四节 二维凝胶电泳分析

第五节 Western blot验证

第六节 q-RT-PCR验证

讨论

结论

第四章 研究总结

参考文献

综述 体外模型在药物性肝损伤的应用进展

博士在读期间所获成果

致谢

附录

声明