探索脂肪组织特异性敲除Sirt6小鼠的代谢表型及SIRT6调控产热的分子机制

摘要

肥胖是诱发Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化和肿瘤的危险因素。虽然肥胖的发病率在30年间翻了一倍，但是目前的医疗界仍然缺乏有效的手段治疗肥胖。考虑到棕色和米色脂肪能够解偶联氧化磷酸化，将化学能转化成热能，增加机体的能量消耗，它们成为了人类战胜肥胖的新希望。SIRT6与Sirtuins家族的其他成员不同，它位于细胞核内的染色质上，是具有ADP-核糖基转移酶和依赖于NAD+的去乙酰化酶活性的蛋白酶。研究表明，SIRT6在调控基因组稳定性、衰老、糖代谢、应激反应、寿命、昼夜节律、心肌肥大和肿瘤的发生及发展中扮演重要角色，但是SIRT6在脂肪组织中的功能还有待发掘。研究表明，SIRT6在棕色脂肪组织中的表达量明显高于其在白色脂肪组织的表达水平，并且肥胖小鼠棕色脂肪组织中SIRT6的表达量显著降低。冷刺激和β-激动剂能够促进SIRT6在棕色和白色皮下脂肪组织中的表达。脂肪组织特异性敲除Sirt6会削弱小鼠棕色脂肪的产热功能，使小鼠的棕色脂肪发生明显的“白色化”，同时小鼠的氧气消耗速率降低、体温下降，并导致敲除小鼠的肥胖。此外，敲除小鼠还有高血脂症、胰岛素抵抗和脂肪肝等异常的代谢表型。脂肪组织特异性敲除Sirt6使得小鼠的能量消耗减少，脂肪酸氧化和产热受到抑制。还发现敲除Sirt6致使小鼠缺乏对冷刺激和β3肾上腺素受体激动剂CL316，243介导的产热产生响应。在原代小鼠棕色脂肪细胞中敲除Sirt6，会显著抑制产热相关基因的表达和线粒体呼吸，反过来，过表达SIRT6则会促进产热基因的表达和线粒体呼吸，基于这些体外实验，认为SIRT6对脂肪组织产热功能的调控具有细胞自主性。对于分子机制的探索，发现SIRT6通过与磷酸化的ATF2发生相互作用，招募磷酸化的ATF2结合到PGC-1α的启动子区，进而增强PGC-1α的表达。因此，脂肪细胞内敲除Sirt6会因磷酸化的ATF2对PGC-1α启动子区的结合减少，从而抑制PGC-1α及其下游基因的表达。我们的研究表明SIRT6对于具有产热功能的脂肪细胞维持其产热作用具有决定性作用，这使得SIRT6成为治疗肥胖和Ⅱ型糖尿病的潜在靶点。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料与仪器设备

1．3 质粒载体

1．4 工具酶及分子量标准

1．5 试剂盒

1．6 主要化学试剂(按试剂公司分列)

1．7 主要仪器及设备

1．8 生物信息学软件及网络资源

1．9 分子生物学软件

1．10 引物序列

2．实验方法

2．1 脂肪组织特异敲除Sirt6小鼠模型的构建及基因型鉴定

2．2 动物饲养和组织处理

2．3 测定小鼠的体重及食物摄入量

2．4 测定小鼠的体脂肪和瘦肉的含量

2．5 测定小鼠各组织的重量百分比

2．6 测定小鼠的能量消耗情况和静息代谢率

2．7 利用红外成像照相机和小动物体温计监测小鼠体温

2．8 诱导小鼠的白色脂肪组织发生棕色化

2．9 葡萄糖耐受实验(glucose tolerance test，GTT)和胰岛素耐受实验(insulin tolerance test，ITT)

2．10 组织化学切片和电镜切片的制备

2．12 质粒载体的构建

2．13 细胞培养

2．14 细胞的瞬时转染

2．15 双荧光素酶报告实验测定启动子活性

2．16 脂肪来源的间充质干细胞的分离及培养

2．17 细胞的油红O染色

2．19 总RNA提取及cDNA合成

2．20 Real-Time PCR实验

2．21 细胞蛋白质的分离制备

2．22 Western Blot

2．23 染色质免疫共沉淀实验(CHIP)

2．24 蛋白质免疫共沉淀

2．25 重组腺病毒的构建

2．26 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒及滴度测定

2．27 统计分析

实验结果

1．SIRT6在脂肪组织中的表达水平受多种因素的调控

2．构建脂肪组织特异性敲除Sirt6的小鼠模型-SIRT6ad-／-

3．脂肪组织特异性敲除Sirt6导致小鼠渐进性肥胖

4．脂肪组织特异性敲除Sirt6使小鼠具有脂肪肝、高血脂症和胰岛素抵抗

5．高脂饮食会加剧SIRT6ad-／-小鼠的肥胖、脂肪肝、高血脂症和胰岛素抵抗等代谢异常表型

6．SIRT6ad-／-小鼠发生肥胖后还伴随有炎症反应

7．脂肪组织特异性敲除Sirt6导致小鼠棕色脂肪组织的产热功能受到抑制

8．脂肪组织特异性敲除Sirt6使小鼠不适应冷刺激并且对CL316，243的介导的产热缺乏响应

9．高脂饮食会加剧SIRT6ad-／-小鼠产热功能的缺失

10．SIRT6对棕色脂肪细胞产热功能的调控具有细胞自主性

11．脂肪组织特异性敲除Sirt6会抑制冷刺激和CL316，243介导的白色脂肪棕色化

12．SIRT6是促进小鼠白色脂肪组织棕色化的重要调控因子

13．脂肪组织特异性敲除Sirt6导致磷酸化的ATF2对PGC-1α启动子区的结合减少，从而抑制产热基因的表达

讨论

小结

参考文献

附录

博士研究生学位论文综述

致谢

作者简介

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