基因重组工具在肿瘤学研究中的应用

摘要

肿瘤已成为全球首要致死原因，给人类社会带来了沉重的疾病负担。深入具体地认识肿瘤发生的分子机制，将极大地协助大家精准地治疗肿瘤，提高患者生活质量和生存时间。作为一种基因组不稳定的体细胞遗传病，肿瘤之间存在很大异质性，并且本身处于不断“进化”的状态，这些特性使得鉴定、验证更多肿瘤相关基因，并实现靶向治疗，依然是一件充满挑战的研究工作。
　　本博士学位论文包括以下三项研究:
　　1、为发现更多肿瘤抑制基因，我们设计并开展了利用转座子在小鼠体内筛选肿瘤抑制基因的工作。在Blm缺失背景的小鼠体内，我们利用piggyBac转座子介导体细胞发生插入突变，干扰基因正常功能，从而诱发肿瘤生长。接着，我们收集了肿瘤标本，提取肿瘤基因组DNA，利用piggyBac序列标签克隆突变位点，并分析筛选的候选肿瘤基因。我们发现，小鼠体内高频次的转座可以导致小鼠胚胎致死;中等频率的转座会引起小鼠出生后生长发育异常;即使低频次的转座也会使小鼠整体生存周期缩短，并诱发肿瘤。在克隆piggyBac插入位点之后，我们可以看到，相比小鼠尾巴中转座子的整合，肿瘤标本中piggyBac插入位点存在明显的富集现象，提示肿瘤克隆扩增特性;piggyBac插入位点数量及其分布与已有研究比较一致;然而，在目前有限的肿瘤标本及测序分析中，我们尚未发现明确的肿瘤抑制基因。本课题的开展，提示我们利用piggyBac在体筛选肿瘤相关基因是可行;当然，为使研究更深入，限定筛选肿瘤的类型并完善相关专业条件也需要考虑。
　　2、为研究Cdk5rap3在小鼠肝细胞癌发生中的作用，我们在肝细胞特异的Cdk5rap3条件性敲除小鼠中，利用DEN诱发肝细胞癌的生长，通过与野生型小鼠观察比较肝癌发生率及肿瘤生长状态，明确该基因缺失对肝癌发生的影响。观察发现，肝细胞特异地敲除Cdk5rap3显著提高了小鼠肝癌发生率，其肿瘤生长数量和质量均远远高于野生型小鼠;让人意外的是，病理分析发现肿瘤细胞中Cdk5rap3表达明显升高，这些细胞并非来自基因敲除的肝细胞。这些结果提示我们，条件性敲除部分肝细胞中Cdk5rap3可以显著提高小鼠肝细胞癌易感性;这一表型的改变更多地来自肝脏内细胞与细胞或细胞与微环境之间的相互作用。
　　3、我们利用全外显子组测序发现在Flt3-ITD敲入小鼠中存在一个耐药变异(Flt3-ITDc.2076T＞A)。为验证该变异会引起肿瘤细胞耐药，我们克隆了cDNA，并将其回复为野生型碱基(Flt3-ITD c.2076T)，在分别转化了Ba/F3细胞系之后检测了细胞对Quazartinib(AC220)、Sorafenib和Ponatinib的敏感性。与预期一致，我们发现，两个编码序列均可顺利转化Ba/F3细胞，均显示了持续活化的激酶活性;与Flt3-ITD c.2076T相比，Flt3-ITD c.2076T＞A使得肿瘤细胞对Quazartinib和Sorafenib表现出耐药，而两株细胞对Ponatinib均敏感，与已有报道结果一致。该实验证实了，Flt3-ITD敲入小鼠中发现的变异与人类白血病细胞FLT3中出现的Gate-keeper耐药突变一样，均会导致肿瘤细胞对Quazartinib和Sorafenib产生耐药性，而Ponatinib可以克服这种耐药。小鼠模型体内存在的耐药突变，提醒我们在使用小鼠模型开展实验研究时需要谨慎设计对照实验，以排除潜在的影响因素。
　　总之，三方面的课题，分别从正向遗传学和反向遗传学的角度，使得自己可以利用多种遗传手段进行肿瘤学相关研究，并对它们有了一定的理解和掌握。

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摘要

导言：肿瘤作为一种体细胞遗传病

参考文献

第一章 利用piggyBac转座子介导的插入突变在Blm缺失小鼠体内筛选肿瘤抑制基因

1．1 前言

1．1．1 高通量肿瘤相关基因的筛选

1．1．2 插入突变系统的应用

1．1．3 实现纯合突变的遗传筛选

1．1．4 实验目的及技术路线

1．2 材料和方法

1．2．1 生物化学药品及试剂

1．2．2 核酸分子材料

1．2．3 小鼠及饲养条件

1．2．4 基因组DNA提取

1．2．5 用PCR鉴定小鼠基因型及其它

1．2．6 qPCR鉴定PB转座子拷贝数

1．2．7 放射线同位素标记Southern印迹杂交

1．2．8 肿瘤标本收集和处理

1．2．9 利用SP-PCR及T载体克隆

4．2．9 二代测序靶向序列建库

1．3 结果

1．3．1 各株系转基因小鼠的建立和传代

1．3．2 转基因小鼠中转座子整合位点及拷贝数

1．3．3 PB转座子可以在小鼠体内发生转座

1．3．4 高频率转座导致小鼠胚胎发育和早期生长异常

1．3．5 转座导致小鼠生存周期缩短且诱导肿瘤发生

1．3．6 SP-PCR联合Sanger测序克隆整合位点

1．3．7 靶向扩增联合二代测序验证EIS

1．3．8 利用转座子作为标签评估肿瘤细胞来源

1．4 结论和讨论

1．4．1 转座可以引起小鼠生长发育异常

1．4．2 转座影响小鼠生存能力并促进肿瘤生长

1．4．3 在肿瘤标本中转座子整合位点存在明显的富集

1．4．4 利用二代测序技术加强识别插入位点

1．4．5 富集位点中基因的大概功能

1．4．6 存在的问题及未来工作

参考文献

第二章 肝细胞特异的Cdk5rap3敲除促进小鼠DEN诱导的肝细胞癌的发生发展

2．1 前言

2．1．1 基因敲除小鼠的发展及应用

2．1．2 肝细胞癌的发生发展

2．1．3 CDK5RAP3的功能研究现状

2．1．4 实验背景及关注问题

2．2 材料和方法

2．2．1 生物化学药品及试剂

2．2．2 核酸分子材料

2．2．3 小鼠来源及饲养条件

2．2．4 化学诱导小鼠肝癌发生

2．2．5 蛋白免疫印迹

2．2．6 免疫组织化学实验

2．3 结果

2．3．1 条件性Cdk5rap3敲除小鼠的建立

2．3．2 肝细胞特异Cdk5rap3敲除小鼠及效率鉴定

2．3．3 部分肝细胞Cdk5rap3缺失促进小鼠肝癌发生

2．3．4 肝癌细胞中Cdk5rap3基因表达E调

2．3．5 Cdk5rap3基因缺失导致自发性结节的产生

2．4 结论和讨论

2．4．1 基因重组效率比已有报道明显较低

2．4．2 Cdk5rap3缺失促进小鼠HCC发生

2．4．3 未来研究计划

参考文献

第三章 发现并验证基因敲入小鼠模型中与Flt3-ITD突变连锁的耐药单核苷酸变异

3．1 前言

3．1．1 AML的分子生物学基础

3．1．2 FLT3基因在AML中的作用机制

3．1．3 TKI治疗和耐药的分子机制

3．1．4 针对FLT3突变的TKI

3．1．5 Flt3小鼠模型的发展及应用

3．1．6 本实验关注焦点及思路

3．2 材料和方法

3．2．1 生物化学药物和试剂

3．2．2 核酸分子材料

3．2．3 细胞系及培养方法

3．2．4 小鼠模型及饲养条件

3．2．5 基因组DNA提取

3．2．6 小鼠基因型鉴定方法

3．2．7 全外显子组测序及数据分析

3．2．8 利用MiSeq进行Amplicon Assay

3．2．9 小鼠原代白血病细胞系的建立

3．2．10 质粒构建

3．2．11 逆转录病毒包装

3．2．12 病毒转导及分选纯化Ba／F3细胞系

3．2．13 Ba／F3细胞系生存能力

3．2．14 各Ba／F3细胞系增殖能力分析

3．2．15 Fluorescence Resonance Energy Transfer

3．2．1 6 STAT5磷酸化分析及蛋白免疫印迹

3．2．17 药物处理及生存状态分析

3．3 结果

3．3．1 小鼠白血病细胞Flt3基因外显子中含有SNV(c．2076T＞A)

3．3．2 Flt3 c．2076T＞A与ITD变异相互连锁

3．3．3 小鼠Flt3-ITD p．F692L等同人类FLT3-ITD p．F691L耐药突变

3．3．4 小鼠原代白血病细胞系对特异性TKI靶向药物出现耐药

3．3．5 Flt3-ITD p．F692L和Flt3-ITD p．F692F均可转化Ba／F3细胞

3．3．6 Flt3-ITD p．F692L使Ba／F3细胞对靶向药物重获敏感

3．4 结论和讨论

3．4．1 Flt3-ITD小鼠模型中携带Gate-keeper耐药突变

3．4．2 该SNV耐药突变产生的起始原因

3．4．3 需谨慎解读该模型实验结果

参考文献

文献综述 肝细胞癌研究中的小鼠模型及应用

附录

致谢

后记

个人简历

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