DNA条形码鉴定中药材和中成药的应用研究

摘要

DNA条形码技术作为新兴的分子生物学鉴定手段，受到越来越多的关注。目前已经作为国家标准，被列入《中国药典》2015版。DNA条形码技术已经有10多年的应用，可以弥补传统的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定的不足，作为传统鉴定方法的有效补充。本文以藏菖蒲、四季青、菟丝子，含人参、川贝母的中成药为例，基于通用的ITS2序列，对DNA条形码技术在中药材鉴定中的可行性进行验证，进而应用于中药材和中成药市场监管的流程方法进行探究。得出以下结论:
　　(1)根茎类药材——藏菖蒲的鉴定:以47份藏菖蒲及其近缘种和混伪品的ITS2序列和从GenBank中获得的49条ITS2序列作为研究对象，进行分析。通过序列比对、构建系统进化树、查找SNP位点、分析变异位点等方法，发现第23位和212位存在稳定的SNP位点，可准确鉴定藏菖蒲。NJ树显示，藏菖蒲可以准确的与混伪品和菖蒲属其他物种进行区分。DNA条形码技术结合SNP可用于鉴定藏菖蒲及其近缘种和混伪品。
　　(2)叶片类药材——四季青的鉴定:以四季青及其近缘种和混伪品的37份植物样本为实验材料，依照标准流程获取DNA并测序。进而结合GenBank中获得28条四季青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾的ITS2序列对冬青种间种内序列进行分析，构建邻接树。冬青从各个方面均能与同属其他物种进行准确区分。所以DNA条形码可以有效地把四季青与其形态相似的混伪品和近缘种进行区分。作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法，DNA条形码技术可以应用于四季青及其近缘种和混伪品的鉴定，同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力。
　　(3)种子类药材——菟丝子的鉴定:基于菟丝子及其近缘种共45份实验样本的207条ITS2序列构建菟丝子鉴定的标准DNA条形码数据库。应用数据库，结合克隆测序，对33份购自药店、医院和药材市场的菟丝子药材进行鉴定。构建邻接树，对标准数据库的鉴定效率进行检测。结果发现69.7％的市售菟丝子药材均存在混伪现象，仅有10份菟丝子药材为正品。混伪物种主要包括绿穗苋、埃塞俄比亚芥、大头菜、藜、中亚虫实、Cuscuta alata、日本菟丝子、单柱菟丝子、茴香、大豆、紫苜蓿等11种。结果表明本研究所用的方法对菟丝子鉴定和市场监管都有很好的效果。
　　(4)中成药的鉴定:以人参健脾丸、人参归脾丸、蛇胆川贝胶囊、启脾丸为4种含有名贵中药材的中成药作为研究对象，利用高通量测序对中成药所含成分的ITS2序列和300 bp短序列进行测序和分析。结果表明，四种中成药中均检测到了正品中药材的近缘种，甚至于本应含有人参的中成药中检测到了比例相近的人参、西洋参，这将严重威胁中成药的用药安全。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 中药材及中成药研究现状

2 中药材及中成药鉴定研究进展

2．1 基原鉴定的特征及其在中药材和中成药鉴定中的应用

2．2 性状鉴定的特征及其在中药材和中成药鉴定中的应用

2．3 显微鉴定的特征及其在中药材和中成药鉴定中的应用

2．4 理化鉴定的特征及其在中药材和中成药鉴定中的应用

2．5 分子鉴定的特征及其在中药材和中成药鉴定中的应用

2．6 DNA条形码与传统鉴定方法相结合在中药材和中成药鉴定中的应用

3 展望

参考文献

第二章 基于SNP位点鉴定藏菖蒲及其近缘种

1 材料与方法

1．1 样品来源

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 藏菖蒲种内分析及SNP位点确定

2．2 利用NJ树鉴定藏菖蒲及其混伪品并验证SNP位点鉴定结果

3 讨论

3．1 SNP位点鉴定为鉴定藏菖蒲的重要方法

3．2 DNA提取和聚合酶链式反应中对温度的要求

4 结论

参考文献

第三章 基于ITS2序列鉴定四季青及其近缘种、混伪品

1 材料与方法

1．1 样品来源

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 DNA提取与PCR扩增成功率分析

2．2 四季青种内序列分析

2．3 四季青及其近缘种、混伪品的ITS2序列分析

2．4 四季青及其近缘种、混伪品的NJ树鉴别及分析

3 讨论

3．1 DNA条形码为植物分类学鉴定提供生物学依据

3．2 DNA条形码为冬青属的鉴定提供新思路

3．3 DNA条形码鉴定冬青属物种的稳定性

4 结论

参考文献

第四章 市售菟丝子药材的真伪鉴定

1 材料方法

1．1 样品来源

1．2 方法

2 结果及分析

2．1 形态鉴定初步分析

2．2 菟丝子标准DNA条形码数据库的构建

2．3 运用BLAST鉴定市售菟丝子样品

2．4 运用NJ树和SNPs鉴定市售样品

3 讨论

3．1 ITS2鉴定菟丝子的优势

3．2 DNA条形码技术检测药材市场混伪品的潜力

4 结论

参考文献

第五章 基于Meta-barcoding的中成药组分分析

1 材料与方法

1．1 样品来源

1．2 方法

2 结果及分析

2．1 蛇胆川贝胶囊

2．2 启脾丸

2．3 人参归脾丸

2．4 人参健脾丸

3 讨论

3．1 短片段结合ITS2鉴定中成药药材组成有助于提高成功率和准确性

3．2 高通量测序是中成药成分解析成为可能

3．3 高通量测序的测序误差无可避免

参考文献

第六章 小结

缩略词

致谢

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