TLR7在EV71感染过程中的作用及利用毛丝鼠和雪貂建立HBV动物模型的探索

摘要

本文从以下两个部分阐述了TLR7在EV71感染过程中的作用及利用毛丝鼠和雪貂建立HBV动物模型的探索。
　　第一部分 TLR7在EV71感染过程中的作用
　　背景:EV71是一种单链RNA嗜神经性病毒，1969年在美国一次被鉴定出来，但其致病机制至今未明确。它是引起手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的常见病毒，一般症状比较轻微，但偶尔会引起非常严重疾病，如无菌性脑膜炎，新生儿致死性脑炎等。自1997年第一次在马来西亚爆发致使41名儿童死亡至今已引起包括中国、新加坡、澳大利亚、越南和柬埔寨等亚洲-太平洋等国的大规模流行，并造成了严重后果。目前并没有有效的临床治疗方案应对，虽然有两种疫苗上市，但其预防效果并没有经历实战考验。Toll样受体(Toll like receptor，TLR)可以激活抗病毒免疫反应，其中TLR7的激活可以诱导产生多种细胞因子，包括Ⅰ型干扰素(IFNs)，起到抗病毒的作用。
　　方法:建立EV71感染的小鼠模型，给予TLR7激动剂(GS-9620)，进行生存率和临床症状的比较。实验检测出最佳给药剂量和方式，在明显提高感染小鼠生存率和缓解临床症状的前提下，H&E和荧光免疫对感染小鼠和感染给药小鼠进行检测，利用CBA、real-time PCR、对正常组小鼠，感染小鼠，感染后给药组小鼠和单独给药组小鼠3天的血清中细胞因子/趋化因子、NF-κB和PI3K相关基因和细胞因子/趋化因子的相关基因的表达。之后进行NF-κB和PI3K的作用对其关键蛋白NF-κB和PI3K进行抑制和/或激活，分组为:正常组，感染组，给药组，PI3K和NF-κB抑制剂组，PI3K抑制剂组;PI3K抑制剂加NF-κB激动剂组，NF-κB抑制剂组，NF-κB抑制剂组加PI3K激动剂组;对这8组实验动物进行生存率和临床症状的观察和分析;在得出有明显差异的情况前提下，进行感染、给药72小时，利用real-timePCR和H&E染色方法，检测肌肉中病毒载量、两条信号通路下游的免疫因子的表达情况和肌肉组织的病理损伤情况。IFN-AR敲除小鼠感染EV71，观察死亡率与病毒载量。
　　结果:MP10为EV71的小鼠适应株，腹腔感染10日龄的ICR小鼠100μl(109TCID50/ml)的过半数致死率，在感染2、26和50小时，给予TLR7激动剂（GS-9620）4.5mg/kg能明显的提高感染小鼠的生存率和临床症状。利用CBA对四组小鼠进行血液细胞因子/趋化因子的检测，发现TLR7激动剂(GS-9620)能够激活免疫反应，增加血液中的IL-1β，IL-5，IL-6，IL-12， IFN-α，IFN-β，IFN-γ， TNF-α，MIP-1α和MCP-1的表达量。为了进一步研究TLR7激动剂(GS-9620)是通过激活机体的免疫反应抑制EV71病毒的复制，从而减轻EV71对于机体的炎症反应，研究显示TLR7激动剂是通过激活NF-κB和PI3K产生免疫反应，利用PI3K和NF-κB的激动剂和/或抑制剂进行检测，发现同时给予PBK和NF-κB抑制剂，感染小鼠在两天内全部死亡，说明PI3K和NF-κB两条信号通路在EV71感染过程中发挥了至关重要的作用。抑制PI3K和NF-κB任何一个蛋白，都会减弱TLR7激动剂(GS-9620)的抗病毒和减轻病理损伤的作用。IFN-AR敲除的小鼠感染EV71后，促进病毒复制，增加小鼠死亡率。
　　结论:TLR7通过激活PI3K和NF-κB信号通路，从而使机体产生免疫反应，增加相关细胞因子/趋化因子的分泌，抑制病毒的复制和病理损伤。
　　第二部分 利用毛丝鼠和雪貂建立HBV动物模型的探索
　　背景:乙型肝炎病毒(Heptitis BVirus，HBV)感染是全球主要的公共健康问题。血清学证据显示，全球大约有30％的人现在或过去感染过HBV，且有2.4亿人为HBV慢性感染者，其中15％-40％很有可能发展成为严重的肝脏疾病，如:肝硬化和肝细胞肝癌。机体感染HBV后，在肝细胞内复制，分泌病毒颗粒可长达数十年，给患者个人生活和家庭造成了极大的痛苦，同时也给社会带来了严重的公共健康问题。目前临床治疗中，尚无根除HBV感染的有效药物。由于HBV感染种属的局限性，除能感染人以外，目前研究显示，HBV尚可感染黑猩猩和树鼩，但是其限制性、局限性等因素，使其作为HBV动物模型的前景仍不乐观，阻碍其机制研究。所以建立新型的、易于饲养与实验操作的、基因明确的HBV动物模型，迫在眉睫。
　　方法:尝试利用毛丝鼠和雪貂感染乙肝患者含有HBV的血清，进行HBV动物模型的建立。利用HBV质粒设置标准曲线，进行real-time PCR确定带有HBV血清的病毒拷贝数。后肢静脉注射感染成年毛丝鼠、皮下注射3日龄毛丝鼠和3日龄雪貂。血清学进行HBV DNA检测和HBsAg、 HBsAb和肝功能的检测;对肝脏组织进行HBV cccDNA的检测、H&E病理检测，免疫组化检测HBsAg抗原。
　　结果:雪貂观察6个月，未在血液中检测出HBV DNA;血清中HBsAb抗体阳性;幼年毛丝鼠和成年毛丝鼠在每个月的血清学HBV DNA检测中，均有一定比例只数检测到HBV DNA; H&E切片显示感染HBV病毒后，肝脏会有轻微的炎症反应;同时血清中的肝脏生化ALT也有一定的变化。
　　结论:雪貂不能感染HBV，毛丝鼠持续观查12个月仍然可以检测出HBV DNA，但是其检出率不高，能否发展成为肝硬化、肝细胞肝癌还需要继续观察与检测。

目录

第一部分 TLR7在EV71感染过程中的作用

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 利用毛丝鼠和雪貂建立HBV动物模型的探索

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 乙型病毒性肝炎动物模型的比较分析

缩略词汇

个人简历

致谢

声明