MWCNT/DOX/TC药物递送系统联合热疗在肝癌治疗中的应用

摘要

碳纳米管(Carbon Nanotubes，CNTs)是近年来常见的一种药物载体，由于其独特的尺寸和结构，使得其在生物学方面具有很好的应用前景，其不仅能够被动穿过多种细胞膜，被肿瘤细胞摄取，而且还能吸收808nm的近红外光(Near Infrared，MR)选择性地引起肿瘤细胞死亡，同时不伤害正常细胞，从而达到化疗与热疗的协同作用。但是，由于碳纳米管本身存在分散性差、易聚集等缺点，限制了其在生物医学领域中的应用，因此，选择合适的材料提高其分散性具有重要的研究意义。
　　壳聚糖(Chitosan，CS)是一种天然的阳离子多糖，具有良好的水溶性、生物相容性及生物可降解性，可以通过非共价吸附的方式与碳纳米管结合，提高碳纳米管分散性。
　　细胞穿膜肽TAT多肽(TAT peptides，TATp)，是目前研究较多的一种细胞穿膜肽，其主要是由碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸组成，带大量正电荷，具有良好的水溶性，能够穿透细胞膜进入细胞质或细胞核中。
　　本论文采用TAT多肽通过共价交联的方法对低分子量的壳聚糖(MW=5000～8000，脱乙酰度＞90％)进行修饰，形成TAT-CS（以下简称TC），并采用TC对羧基化的多壁碳纳米管(MWCNT-COOH)进行修饰，以期增强其分散性和细胞穿膜性。研究将化疗药物DOX通过非共价吸附的方式结合于碳纳米管上，然后采用TC对其进行修饰，制备MWCNT/DOX/TC载药系统，利用碳纳米管本身对近红外光具有选择性吸收的特性，将化疗与热疗联合起来，探讨其对肝癌的治疗效果。具体内容主要从以下几个方面展开：
　　1.MWCNT/DOX/TC复合物的制备及表征
　　将不同比例的DOX/MWCNT混合，TC通过非共价吸附的方式结合于MWCNT/DOX复合物表面，通过透析法计算不同投料比条件下的包封率和载药量;并探讨其在体外不同条件下的释放行为。
　　结果表明：投料比为DOX/MWCNT=3/1时，载药量达到最大;且其体外释放行为具有pH响应性。Zeta电位值的测量结果表明，DOX及TC的修饰均能增大MWCNT-COOH的电位值;采用透射电镜观察了MWCNT、MWCNT/DOX和MWCNT/DOX/TC的表面形态，结果显示，三者的表面形态基本一致;拉曼光谱分析结果显示，三者的I(D)/I(G)(1315/1599cm-1)比值也没有明显差异，上述结果提示，负载DOX或TC对MWCNT的结构没有产生明显影响。UV-可见光扫谱及FTIR分析结果均能证明DOX能有效地吸附于碳纳米管上。
　　2.MWCNT/DOX/TC作为药物递送载体及体内影像跟踪评价
　　采用激光共聚焦显微镜观察了载药系统在肝癌细胞BEL-7402内的分布，结果显示，MWCNT/DOX/TC可以被肝癌细胞有效摄入，并可在胞浆中将DOX释放出来并进入胞核从而发挥其生物学功能。
　　为了观察药物递送系统对细胞的毒性，将BEL-7402与DOX、MWCNT/DOX、MWCNT/TC或MWCNT/DOX/TC分别培养后观察细胞活力，结果显示：MWCNT/TC本身对肝癌细胞的活力只有轻微抑制;MWCNT/DOX/TC及MWCNT/DOX、DOX处理组对细胞活力的抑制作用有一定增强作用。通过皮下接种表达荧光素酶的肝癌细胞BEL-7402构建裸鼠肝癌动物模型，观察注射不同剂量的MWCNT/DOX/TC对肿瘤的抑制效果，体内影像实时跟踪药物释放。
　　结果显示，该药物递送载体可以有效地增强DOX在瘤内的驻留时间，起到缓释效果。
　　3.MWCNT/DOX/TC药物递送系统在化疗-热疗联合应用中的效果研究
　　为了观察NIR照射是否会刺激DOX从药物载体上的释放，我们研究了DOX在不同pH值以及有无NIR条件下的释放情况，结果显示，NIR的存在并未对DOX的释放有明显的影响;体外细胞实验中，CCK-8检测细胞毒性的结果显示，MWCNT/TC存在的情况下，NIR照射组的细胞活力明显低于无NIR照射的组别，说明药物载体MWCNT/TC存在的条件下NIR的照射能抑制细胞的生长;
　　为了观察化疗与热疗联合条件下对肿瘤生长的抑制效果，利用DOX固有的红色荧光，我们采用活体动物成像技术观察了DOX在肿瘤内的驻留情况。
　　结果显示：MWCNT/DOX/TC能够明显延长DOX在肿瘤组织中的驻留时间，NIR的照射对载药系统中DOX的释放没有明显影响。
　　利用在体生物发光成像技术，采用小动物活体成像仪实时跟踪观察了纳米载药系统的抗肿瘤效果，观察时间为25天。
　　结果显示，MWCNT/DOX/TC与NIR照射联用的抗肿瘤效果最为显著。
　　综上可知，MWCNT-COOH能有效地吸附化疗药物DOX，TAT-CS修饰后可以显著提高其分散性和细胞穿膜效应，降低碳纳米管的毒性。体外细胞实验证实此药物载体对细胞无明显的毒副作用，且此载体可以有效地控制DOX在细胞内的缓慢持续释放;体内实验证明此药物载体可以有效地延长药物在瘤内的驻留时间;同时也证明在NIR的照射下，其抑瘤效果能显著提高，这些研究证明MWCNT/DOX/TC药物递送系统对肿瘤联合治疗具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 碳纳米管简介及碳纳米管的功能化

1．2 碳纳米管在抗肿瘤药物载体方面的应用

1．2．2 非共价吸附药物于碳纳米管

1．2．3 药物填充于碳纳米管

1．2．4 药物释放

1．3 碳纳米管在肿瘤热疗方面的应用

1．4 在体光学成像技术在观察肿瘤生长、转移中的应用

1．5 课题的提出

参考文献

第二章：MWCNT／DOX／TC递送系统在肿瘤治疗中的应用研究

2．1 引言

2．2 实验材料与试剂

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验耗材及仪器

2．3 实验方法

2．3．1 TAT多肽的设计与合成

2．3．2 MWCNT／DOX／TC样品的制备

2．3．3 阿霉素标准曲线的绘制

2．3．4 包封率、载药量的测定

2．3．5 Zeta电位分析

2．3．6 透射电子显微镜分析

2．3．7 傅里叶红外光谱分析

2．3．9 DOX体外释放测定

2．3．10 体外细胞实验MWCNT／DOX／TC样品的制备

2．3．11 细胞的培养

2．3．12 MWCNT／DOX／TC对肝癌细胞生长影响的研究

2．3．13 人肝癌裸鼠皮下模型的建立

2．3．14 动物实验给药的制备

2．3．15 实验动物分组及给药

2．4 结果与讨论

2．4．2 DOX标准曲线的绘制

2．4．3 不同投料比条件下MWCNT／DOX／TC复合物的表面电位、包封率及载药量的测定结果

2．4．4 投料比为3／1时MWCNT／DOX／TC复合物的红外光谱图，紫外-可见光谱扫描及Zeta电位表征

2．4．5 DOX体外释放研究

2．4．6 高内涵成像系统观察结果

2．4．7 MWCNT／DOX／TC对BEL-7402细胞生长影响结果

2．4．8 实验结果与讨论

3．小结

参考文献

第三章：MWCNT／DOX／TC联合热疗抗肿瘤的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与试剂

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验耗材及仪器

3．3 实验方法

3．3．2 MWCNT／DOX／TC载药系统体外热转换效率的研究

3．3．3 MWCNT／DOX／TC样品的制备及体外释放的研究

3．3．4 化疗联合热疗的体外效果研究

3．3．5 通过共聚焦成像系统观察BEL-7402细胞对MWCNT／DOX／TC及DOX的细胞内分布及释药研究

3．3．6 人肝癌裸鼠皮下模型的建立

3．3．7 动物实验给药的制备

3．3．8 实验动物分组及给药

3．3．9 NIR照射条件下肿瘤局部温度变化

3．3．10 MWCNT／DOX／TC联合NIR照射抗肿瘤效果的动物实验研究

3．4 实验结果与讨论

3．4．2 MWCNT-COOH及MWCNT／TC、MWCNT／DOX、MWCNT／DOX／TC体外热转换效率的研究结果

3．4．3 MWCNT／DOX／TC载药系统在不同pH值及有无808 nm NIR照射时的体外释放研究结果

3．4．4 MWCNT／DOX／TC载药系统的细胞内分布及释药情况的研究结果

3．4．5 MWCNT／DOX／TC联合NIR照射对肝癌细胞生长影响的研究结果

3．4．6 热疗条件下肿瘤局部温度变化

3．4．7 化疗联合热疗条件下肿瘤局部DOX的驻留情况及抗肿瘤效果

4．小结

参考文献

第四章 总结

致谢

硕士期间科研成果