慢性丙型肝炎患者尿液中丙型肝炎病毒RNA的定量检测及其片段分布的研究

摘要

丙型肝炎是全球性的公共卫生问题。据估计，全世界约有超过1.7亿人感染慢性丙型肝炎，其中约10-20％会发展为严重的肝脏疾病，如肝硬化和肝细胞癌。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是丙型肝炎的致病因子，是一种小型的正向单链RNA病毒，HCVRNA的检测对于丙型肝炎的临床诊断和治疗监测是必不可少的，HCV的定量核酸检测已成为丙型肝炎抗病毒治疗过程中疗效监测以及临床决策的关键参数。 由于HCV传播的肠胃外模式，血液是用于检测HCVRNA的主要样本类型。然而，有报道表明，大约15-40％的丙型肝炎患者没有可识别的胃肠外感染途径。为了评估HCV感染可能的非肠胃道途径，研究者尝试在除血液以外的体液中检测HCVRNA。之前的文献中所研究的体液主要包括唾液、尿液、腹水、龈沟液等，并且有研究确实在这些体液中检测到了HCV RNA，但检出率各有不同，甚至差异较大。 尿液是一种超级无创的样本来源，与血液相比具有显著的优势，包括非侵入式无创采样，采集的便捷性以及对医务工作者的生物风险低，特别是对于需要频繁重复采样以监测抗病毒治疗效果的慢性丙肝患者以及新生儿、儿童这类采集比较困难的患者群体，尿液的这种优势更为明显。之前对于尿液中HCV RNA检测的研究中，虽然在尿液中不同程度地检测到了HCV RNA的存在，但是检出率相差较大，从0至56％不等，且HCVRNA的来源以及存在形式均未阐明。HCV肝外复制的场所不包含泌尿系统的组织器官，这就排除了HCV病毒颗粒在泌尿系统的组织细胞内复制并分泌进入尿液的可能性。同时，多项研究表明尿液中存在来自血液循环的短片段的游离核酸。因此，我们能够合理地推测尿液中的HCV RNA很可能是从血液中经由肾小球的滤过而进入到尿液中，并且可能以短片段的形式存在，因为肾小球滤过系统仅允许直径＜6.4nm且分子量＜70kDa的小型分子转运通过。然而，之前的文献中所报道的尿液HCV RNA的检测方法存在一定的缺陷，其核酸提取和基于PCR的检测方法均未考虑到小片段HCVRNA存在的可能性，无法有效地提取和扩增小片段的HCVRNA，这样就会造成漏检，使检测不够灵敏和准确，检测结果不能准确地反映尿液中HCVRNA的真实含量和存在形式，也就无法准确地判断尿液中HCVRNA的存在所造成的流行病学和疾病传染传播的意义以及作为检测指标所存在的潜在的临床意义和应用价值。 因此，为了克服之前的尿液HCVRNA提取和检测方法的缺陷，更加灵敏、准确地检测尿液中HCVRNA的水平，本研究建立了一种新的逆转录实时荧光定量PCR检测方法，该方法改进了核酸提取方法，可以有效提取大于18nt的RNA片段，同时，采用针对小片段HCVRNA设计的短扩增子(62bp)，能够更有效地检测尿液中的HCV RNA。我们使用自建的含HCV RNA片段的模拟尿液样本对新建立的定量PCR方法进行了检测下限、精密度、线性和特异性的评估，结果证明该检测体系具有高质量的性能表现。本研究纳入95例慢性丙肝患者，其中60例为血浆HCV RNA阳性，其他35例为阴性。使用新建的检测体系对95例慢性丙肝患者尿液中的HCV RNA进行了定量检测，在血浆HCV RNA阳性的60例样本中，有36例(60％)可以检测到尿液HCV RNA;而在血浆HCV RNA阴性的35例样本中，均未检测到尿液HCV RNA。在本研究中，除最短的62bp的扩增子外，我们还设计了另外三种不同大小的扩增子（分别为157，222和307bp）来探究扩增子大小对尿液HCV RNA检测效率的影响以及尿液中HCV RNA片段大小的分布情况。采用四种扩增子检测的结果显示：使用157bp扩增子进行检测时，HCV病毒血症患者尿液HCV RNA的检出率和浓度与使用62bp扩增子的检测结果相比均显著降低(P＜0.001)，而在使用更长的222bp和304bp扩增子的检测中，尿液HCV RNA均无法检出。这证明了62bp扩增子在尿液HCVRNA的检测中可获得最高的检测效率，也证明了新建检测方法中小片段扩增子设计的合理性和有效性。对尿液中HCV RNA片段大小分布的研究结果显示，当扩增片段的大小从62bp增加到157bp时，所能检测到的HCV RNA的相对浓度下降了接近90％，而更长的扩增子（222bp和304bp）则无法检测到尿液中的HCV RNA，证明慢性丙肝患者尿液中的HCV RNA分子主要以短片段形式存在，且大部分片段长度小于157bp。此外，根据62bp扩增子的检测结果，我们发现尿液HCV RNA阳性的患者其血浆HCV RNA水平显著高于尿液HCV RNA阴性者(P＜0.001)，并且血浆和尿液HCVRNA浓度呈显著正相关(R2=0.708，P＜0.001)。 综上所述，本研究通过核酸提取方法的改进以及短扩增片段的应用，建立了新的逆转录实时荧光定量PCR检测方法，用于定量检测慢性丙型肝炎患者尿液中的HCV RNA，并对尿液中HCV RNA的片段大小分布及其临床应用价值进行了探究。本研究的结果表明，新建立的定量PCR检测方法在方法学评价上展示了很好的性能表现，在用于临床尿液标本的检测时，显著提高了尿液HCV RNA检测的灵敏度，并证实了尿液中小片段HCV RNA的存在。此外，通过对血液和尿液中HCV RNA浓度的临床相关性分析，证明尿液中HCV RNA的浓度与血液中的浓度呈显著正相关，提示尿液HCV RNA可以作为慢性丙型肝炎患者诊断和抗病毒治疗过程中用于监测疗效的潜在的超级无创生物标志物，具有潜在的临床应用价值。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

1．1．1实验仪器

1．1．2实验耗材

1．1．3实验试剂

1．1．4溶液配制

1．1．5载体及菌株

1．1．6生物样本

1．2方法

1．2．1尿液HCV RNA检测体系的建立

1．2．2模拟样本的制备

1．2．3检测体系的方法学性能评价

1．2．4血浆HCV RNA的定量检测

1．2．5尿液HCV RNA的定量检测

1．3数据统计分析

2．结果

2．1尿液HCV RNA新检测体系的确立

2．1．2扩增体系和循环参数的确定

2．1．3尿液HCV RNA新检测体系

2．1．4尿液常规生化分析结果

2．2．1目的片段扩增产物的验证

2．2．2以质粒为模板的目的片段的获取

2．2．3体外转录

2．2．4模拟样本的配制

2．3检测体系的方法学性能评价

2．3．1分析灵敏度

2．3．2精密度

2．3．3特异性

2．3．4线性

2．4血浆HCV RNA的定量检测

2．5尿液HCV RNA的定量检测

2．5．1尿液HCV RNA的绝对定量检测

2．5．2尿液HCV RNA片段大小分布的探宄

2．6血液和尿液中HCV RNA浓度的临床相关性分析

3．讨论

参考文献

论文综述

附录

致谢

个人简介