免疫性睾丸炎生精障碍和胰岛素调控下丘脑--垂体--性腺轴功能的分子机制

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 免疫球蛋白G Fc区域Asn297位点糖基化异常引发免疫性睾丸炎和生精障碍的分子机制 研究目的： 探索免疫球蛋白G结晶片段保守区第297位天冬酰胺位点糖基化异常引发免疫性睾丸炎的分子机制，以及曲细精管中白细胞产生过多的活性氧抑制抗氧化剂，损伤精原细胞DNA和精子质膜的机制。 研究方法： 本研究收集127例免疫性睾丸炎患者的血清样本，单分子实时(Single-molecule real-time，SMRT)环状一致测序（Circular consensus sequencing，CCS）用于IgG的Fc区域Asn297位点蛋白结构序列数据分析，求出蛋白质片段的氨基酸出现频率的香农熵值，获得突变位点，Sanger测序验证Asn297基因突变位点的正确性。荧光酶标仪检测精液ROS的含量，并结合生化检查、组织病理和免疫组化检查结果，综合分析并阐述免疫性睾丸炎的发病机制。 研究结果： 患者血清IgG浓度为2231.4±291.5mg/dl，高于正常范围80～1400mg/dl，而38例对照组为386.3±182.6mg/dl。患者血清50％溶血单位补体(CH50)浓度为128.32±61.51U/ml，显著高于正常值(23～46U/ml)，而对照组相应浓度为31.43±8.37U/ml。患者血清补体C3浓度为5.23±2.36g/L，显著高于正常值(0.9～1.8g/L)，而对照组补体C3浓度为1.2±0.3g/L。试验组与对照组的t检验表明二者具有统计学上的差异(p＜0.05)。精液中活性氧簇的测量值，患者组的O2·-、H2O2、和·OH的浓度明显高于对照组。患者的IgG Fc区域(294～300)氨基酸总体多样性比对照组健康男性更高，表明患者的基因序列Asn297周围7个氨基酸的变化较大，而对照组297位点氨基酸为固定的高频率的天冬酰胺。有36例患者在Asn297位点(CAC)突变为(AAC)。第6号外显子891密码子的突变是A到C的替换，这导致了这种氨基酸从天冬酰胺转化为其他的氨基酸。96人(96/127，75.59％)存在Asn297位点突变和去糖基化现象，31例患者第6号外显子的892密码子存在病理性突变，即天冬酰胺（AAC）转变为丝氨酸(AGC)。29例IgG基因插入或删除的移码突变。31例没有证据表明在Asn297基因突变，他们可能有其他位点基因突变，尚未检出。与此相反，对38名健康男性的IgG基因没有检测到突变。根据GenBank中公开发表的结果，Asn297位点的天冬酰胺突变发生在健康人中是非常低的。免疫组织化学染色结果提示，睾丸、附睾和鞘膜组织内有免疫复合物沉积和大量淋巴浆细胞浸润;小血管壁增厚，血管腔内有大量中性粒细胞;曲细精管基底膜纤维化，腔内仅见支持细胞，生精上皮变薄、空泡化，生精细胞排列紊乱。 研究结论： IgG Asn297位点糖基化异常，能够引发免疫性睾丸炎;曲细精管内活性氧簇增多引起精原细胞的DNA损伤，导致生精障碍。 第二部分 胰岛素合成代谢与下丘脑-垂体-性腺轴功能互作机制 研究目的： 研究胰岛素调节下丘脑-垂体-性腺轴上游调节因子kisspeptin的基因转录和表达。观察下丘脑侧脑室输注不同浓度胰岛素对大鼠下丘脑kisspeptin的表达变化及生殖功能改变，揭示胰岛素通过中枢调节生殖功能的分子作用。 研究方法：运用徼流控芯片等先进技术，通过Gnv-3细胞三维培养，细胞内涵物分析，胰岛素影响kisspeptin翻译的示踪、提取、捕获、裂解、分选、液相质谱分析等过程，观察下丘脑kisspeptin基因转录和表达的变化情况。并借助各种动物模型的不同胰岛素浓度干预，用胰岛素0.2 U/mL、2.0 U/mL和10 U/mL干预72h，评价干预6h、24 h、48 h和72h后kispepetine mRNA (Real-Time PCR)和蛋白表达量（Western印迹）的变化。用胰岛素0.2 U/kg、 2.0 U/kg和10 U/kg干预去势雄性大鼠4周;雌性卵巢切除大鼠脑立体定位侧脑室注射胰岛素，给大鼠下丘脑每4个小时注射一次，剂量为2 IU/kg;检测干预前后LH水平和下丘脑视前区kisspeptin免疫组织化学染色变化。 研究结果：在雄性SD大鼠使用链脲佐菌素(STZ)致胰腺异常模型的研究中，正常组10只大鼠的总睾酮为56.2±6.3 ng/dl，胰腺异常组(n=13)大鼠的总睾酮值为37.8±7.4ng/dl，P＜0.05。正常组大鼠的LH为5.3±1.2 ng/dl，胰腺异常组大鼠的LH值为2.1±0.9 ng/dl，P＜0.05。免疫组化的结果显示胰岛素分泌异常组大鼠下丘脑弓状核 的kisspeptin免疫阳性的细胞个数明显低于对照组，正常组大鼠的kiss-ir细胞数量为428.0±46.0 ng/dl，胰腺异常组大鼠的kiss-ir细胞数值为216.0±24.0 ng/dl，P＜0.05。胰岛素及RAPA干预调节Gnv-3细胞中mTOR蛋白表达水平和亚细胞分布，Control为对照，Gnv-3细胞用胰岛素(0.2，2.0U)，及RAPA (300ng/ml)孵育24小时后提取细胞浆蛋白/核蛋白及总蛋白，用Western Blot法检测SP1蛋白的表达水平，RT-PCR证实Gnv-3细胞上表达IR受体。对正常及卵巢切除、卵巢切除并行胰岛素注射三组雌性大鼠的下丘脑弓状核kiss1-ir细胞进行计量分析，结果显示卵巢切除组SD大鼠下丘脑kiss1-ir细胞明显较其它两组减少，而正常组和卵巢切除并行胰岛素注射组组无明显差异。去势大鼠LH水平逐渐升高，在去势4周后LH达(5.78±2.84)ng/mL，较去势前LH水平（0.90±0.26）ng/mL明显升高，FSH达（76.32±22.46）mIU/mL，较去势前FSH水平(22.90±8.26) mIU/mL明显升高，P＜0.01。小剂量胰岛素(0.2 IU/kg)干预去势大鼠4周后，LH水平(5.29±2.14) ng/mL，和对照组比较变化不明显。中等剂量的胰岛素(2.0 IU/kg)干预去势大鼠4周后，LH水平（3.21±1.86）ng/mL，和对照组比较明显下降，P＜0.05;大剂量(10 IU/kg)干预去势大鼠4周后，LH水平（7.21±2.92）ng/mL，较对照组明显上升，均P＜0.05。和对照组比较，小剂量胰岛素(0.1 IU/kg)干预去势大鼠4周后，下丘脑视前区kisspeptin免疫组织化学染色表达稍有上升。中等剂量的胰岛素(1 IU/kg)干预去势大鼠4周后下丘脑视前区kisspeptin免疫组织化学染色表达明显上升，P＜0.05;大剂量(10 IU/kg)干预去势大鼠4周后，大鼠下丘脑视前区kisspeptin免疫组织化学染色表达显著性差异，表现为抑制状态，P＜0.05。 研究结论：胰岛素可以通过上调下丘脑视前区Kisspeptin表达，参与兴奋雄性大鼠性腺轴功能;在雌性大鼠卵巢切除模型中，胰岛素通过mTOR途径调控下丘脑Kisspeptin，提高生殖功能。

目录

摘要

第一部分IgG Fc区域Asn297位点糖基化异常引发免疫性睾丸炎和生精障碍的分子机制

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：胰岛素合成代谢与下丘脑-垂体-性腺轴功能互作机制

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

结论

参考文献

论文综述

中英文对照及缩略词表

论文题录

致谢

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