Armored RNA技术在登革热病毒及白血病BCR--ABL1p210/p190融合基因检测中的应用研究

摘要

Armored RNA技术是近年来发展起来的一种主要用于制备RNA质控品和标准品的技术。其原理是利用基因工程手段将载有大肠杆菌MS2噬菌体衣壳蛋白的基因序列和外源性基因序列克隆到表达载体中，然后将外源性基因片段转录成RNA，并包裹在MS2衣壳蛋白基因表达的衣壳蛋白中，最终装配成球状RNA-蛋白质复合体，一般称为“盔甲RNA”（armored RNA），或MS2病毒样颗粒(MS2virus-like particle，MS2VLP)。由于有外层衣壳蛋白的保护，内部的RNA片段能抵抗环境中存在的RNA酶的降解而保持稳定;同时，armored RNA整体结构又很好模拟了病毒的天然属性。所以，armored RNA技术在疾病诊断，尤其是在感染性疾病的诊断中具有很大的临床应用价值。我们前期的研究已经使用armored RNA技术成功制备了流行性感冒、埃博拉以及中东呼吸综合征等多种相关疾病病毒的armored RNAs，并在国内成功开展了这些项目核酸检测的室间质量评价(External quality assessment，EQA)。 登革热是由登革热病毒引起、经伊蚊传播的一种急性传染病。登革热在世界上广泛传播，但主要在热带和亚热带流行，给流行地区带了极大的经济负担和社会负担。2014年，广州因输入性病例而爆发登革热，并蔓延至全省20多个地级市和其他省份，全国全年累计病例超过4.6万;2015年至2017年，全国每年都有数千例登革热病毒感染的相关报道。慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)和急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)是白血病中比较常见的两种类型。绝大多数CML和少部分ALL患者以出现费城染色体(Philadelphia chromosome，Ph)为主要特征。Ph为22号染色体与9号染色体发生易位形成新的染色体，表现为22号染色体长臂区段易位至9号染色体长臂上，致使基因BCR（Breakpoint cluster region）和ABL1基因融合(BCR-ABL1)，即t(9;22)(q34;q11)，其中CML以p210型BCR-ABL1融合基因(Fusion gene，FG)为主，ALL以p190型BCR-ABL1融合基因为主。针对登革热病毒核酸和BCR-ABL1融合基因转录本的荧光定量PCR(RT-qPCR)技术是一种常规、快速的检测方法，在登革热和白血病的诊断和病情评估中发挥着非常重要的作用，目前被国内绝大多数实验室使用。 但是，RT-qPCR核酸分子检测由于操作步骤较多，容易受很多因素影响，导致检测结果不稳定。EQA可用于比较不同实验室之间的检测结果，可以发现实验室检测中存在的问题，是一种提高实验室内部检测能力的有效手段。目前，不管是登革热还是白血病，在国内都还没有开展RT-qPCR核酸分子检测相关的EQA活动。基于此，本研究使用armored RNA技术制备了登革热病毒检测质评样本（见第一部分）和BCR-ABL1融合基因检测质评样本（见第二部分），并首次在国内开展了这两个项目的EQA活动。 在第一部分中，我们制备了登革热病毒1～4型质评样本，每型包含5支阳性样本和3支阴性样本，全国共计20家实验室参加。 结果显示，参评实验室对质评样本检测的准确度、灵敏度和特性度分别为89.6％(569/635)，85.1％(336/395)和97.1％(233/240)。5家实验室检测结果的正确率为100.0％，评为“优秀”;11家实验室检测结果的正确率介于80.0～100.0％，评为“合格”;4家实验室检测结果的正确率小于80.0％，评为“不合格”。在第二部分中，我们制备了p210型和p190型BCR-ABL1质评样本，每种质评样本包含9支不同％BCR-ABL1比值的阳性样本（其中1支为基准样本）和1支阴性样本，全国共计66家实验室参加。 结果显示，对同一个样本来说，不同实验室检测结果的极差，即检测结果的最大值和最小值相差很大，不管是p210BCR-ABL1检测结果还是p190BCR-ABL1检测结果，样本变异系数(CV％)基本超过60％，部分样本超过100.0％，甚至超过200.0％;但是，总体来看p210样本检测结果的CV％稍低于p190样本。对24家可以转化至国际单位（International scale，IS）的实验室来说，p210BCR-ABL1检测结果经过转换系数（Conversion factor，CF）换算后，所有样本检测结果的CV％均降低;但是，3家实验室的％BCR-ABL11S上报结果较转换前反而偏离检测均值。随访后发现，其中2家实验室RT-qPCR检测平台的组分发生改变导致CF变化而影响了％BCR-ABL1转化。最后，按照UK NEQAS评分标准，分别有47家和51家实验室通过本次BCR-ABL1融合基因检测EQA。第一部分和第二部分的研究结果说明，不管是登革热病毒，还是BCR-ABL1融合基因的RT-qPCR核酸检测，在我国的实验室都存在一些问题。解决这些问题，对降低我国临床实验室对登革热和白血病检测结果的变异，以及提高临床医师对这两类疾病的诊断和管理水平非常重要。 使用统一的标准品可以降低BCR-ABL1融合基因在不同实验室检测结果之间的变异;但是，目前国内外使用的标准品，基本上都是质粒或cDNA。质粒或cDNA做为标准品不能反应RNA提取和cDNA合成过程。基于此，本研究使用armored RNA技术制备了p210型和p190型BCR-ABL1融合基因标准品（见第三部分）。在该部分中，为了消除使用不同标准曲线对BCR-ABL1融合基因和内参基因引起的变异，我们通过重叠PCR(Overlap extension PCR，OE-PCR)技术将p210型或p190型BCR-ABL1FG与内参基因（Control gene，CG）进行了1∶1连接;同时，为了提高p210型和p190型BCR-ABL1融合基因标准品的适用性，我们选择了4种国际推荐的CGs（ABL1、BCR、GUSB以及B2M）。本研究制备的标准品（命名为p210FG-CG和p190FG-CG）随第二部分中p210型和p190型BCR-ABL1质评样本一起发放至参评实验室进行评估。 结果显示，当使用当地标准品时，检测结果CV％大于80％的p210和p190模拟样本分别占33.3％(3/9)和55.6％(5/9);CV％介于50％～80％分别占66.7％(6/9)和44.4％(4/9);两个项目均无样本检测结果CV％小于50％。当使用p210FG-CG和p190FG-CG标准品时，检测结果CV％大于80％、介于50％～80％和小于50％的模拟样本均占33.3％(3/9)。另外，本研究还发现，不管是p210质评项目还是p190质评项目，对使用自建方法（Laboratory developed tests，LDT）或使用过柱法进行RNA抽提的实验室来说，BCR-ABL1检测结果的变异度明显小于使用商品化试剂盒和TRIzol试剂的实验室。该部分研究说明，使用p210FG-CG或p190FG-CG统一的标准品可以在一定程度降低不同实验室之间检测结果变异度，尤其是对使用LDT或使用过柱法进行RNA抽提的实验室。 虽然通过使用统一的标准品可以提高实验室检测结果的一致性，但是不能将当地实验室％BCR-ABL1结果溯源至％BCR-ABL1IS。目前，国际上已经通过两条主要途径实现了p210型BCR-ABL1融合基因检测的标准化，这两条途径为样本交换和参考物质。但是，通过样本交换的形式进行％BCR-ABL1溯源，整个过程费时、费力，仅适合部分实验室;同时，目前p190型BCR-ABL1融合基因检测尚未实现标准化。所以，为了更好地实现我国BCR-ABL1融合基因检测的标准化，尤其是对p190型BCR-ABL1融合基因，我们用armored RNA技术制备包含p210和p190型BCR-ABL1融合基因的二级参考物质（见第四部分）。为了保证p210和p190型BCR-ABL1融合基因RT-qPCR扩增片段的长度不发生变化，我们通过三轮OE-PCR将p190BCR-ABL1融合基因外显子e1下游75bp完全替换p210BCR-ABL1融合基因的e14外显子(75bp)。4个水平的BCR-ABL1融合基因二级参考物质制备成功后，使用1st WHO国际白血病BCR-ABL1融合基因定量检测基因参考盘(NIBSC编码：09/138)进行定值，并在国内41家实验室进行区域性验证。 结果显示，在33家参加的实验室中，获得有效转化系数的实验室为25家(p210)和28家(p190)，分别占75.8％和84.8％。对15家获得有效CF的IS实验室中，通过二级参考物质获得的CF与通过样本交换方式获得CF一致的实验室占80.0％(12/15)。 综上所述，本研究成功地利用armored RNA技术制备了登革热病毒和白血病BCR-ABL1p210/p190融合基因质评样本、BCR-ABL1p210/p190融合基因标准品和二级参考物质。本研究所做的工作对发现我国实验室在登革热和白血病的核酸检测中存在的问题并寻求解决方案，以提高实验室的检查能力有积极的促进作用，尤其是对提高我国实验室白血病BCR-ABL1融合基因检测的一致性及推动白血病BCR-ABL1融合基因检测的标准化进程等方面将发挥关键的作用。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一部分基于Armored RNA技术的登革热病毒核酸检测质控品的研制及室间质量评价

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．pACYC-MS2-DENV-1～4重组质粒的验证

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．4．DENV-1～4 VLPs性能验证结果

2．5．DENV-1～4 VLPs检测的室间质量评价

3．讨论

参考文献

第二部分基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1p210／p190融合基因检测质控品的研制及室间质量评价

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．pACYC-MS2-p210、pACYC-MS2-p190、pACYC-MS2-CG重组质粒的验证

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．4．p210、p190和CG VLPs性能验证结果

2．5．BCR-ABL1p210／p190 FG检测的室间质量评价

3．讨论

参考文献

第三部分基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1p210／p190融合基因检测标准品的研制及评估

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1pACYC-MS2-p210FG-CG、pACYC-MS2-p190FG-CG重组质粒的验证

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．4．p210FG-CG和p190FG-CG标准品性能验证

2．5．p210FG-CG、p190FG-CG标准品S1定值

2．6．p210FG-CG、p190FG-CG标准品线性分析

2．7．p210FG-CG、p190FG-CG标准品的区域性验证

3．讨论

参考文献

第四部分基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1p210／p190融合基因检测二级参考物质的制备及标准化研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．pACYC-MS2-23S、pACYC-MS2-p210-p190FG重组质粒的验证

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．4．p210-p190FG二级参考物质定值

2．5．二级参考物质的性能验证

2．6．二级参考物质的区域性验证

3．讨论

参考文献

论文综述 A Novel Delivery Platform Based on Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles

附录

致谢

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