复制缺陷型H1N1甲型流感病毒的构建与生物学特性分析

摘要

1918年流感大流行距今已有整整100年的时间，这100年来流感病毒时时刻刻都威胁着人类的生命健康，同时还给人类带来了巨大的经济负担。人类亟待从根本上认识流感病毒，剖析其复制传播和致病机制，并以此为基础开发高效流感疫苗和特效药物。随着上个世纪六十年代末期分子生物学技术的不断进步和成熟，基因重组技术开始被广泛的应用于生命科学研究的各个领域。在此后的几十年中，流感病毒反向遗传学技术得到了极大的发展并为流感病毒的致病机制研究，以及流感疫苗的研发工作提供了强有力的技术支撑。二十世纪末，科学家们开始尝试利用流感病毒反向遗传学技术构建各种不同类型的复制缺陷型流感病毒。复制缺陷型流感病毒最大的特点是复制依赖于外源性的蛋白补偿，在天然宿主细胞中仅发生单轮感染并不能进行复制增殖。较之野生型病毒，复制缺陷型流感病毒的生物安全性得到了极大的提高。但目前复制缺陷型流感病毒相关研究工作存在一定的局限性，研究工作大多在细胞水平上开展，缺乏相应的动物模型与之配合。 本课题以2009年甲型H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)的鼠适应株UIXD-P18-2(UI182)为骨架，利用8质粒流感病毒反向遗传学系统，通过体外拯救获得了一株复制缺陷型甲型H1N1流感病毒，并构建了相应的转基因细胞株以及转基因小鼠感染模型，为更充分的利用复制缺陷型流感病毒开展流感病毒复制传播和致病机制的相关研究提供技术层面上的支持。本研究分别从以下四个方面展开： 一、构建10株用于复制缺陷型甲型H1N1流感病毒体外拯救或体外增殖的转基因细胞株。通过质粒转染结合抗生素筛选、观察报告基因表达情况以初步筛选、以RT-PCR和Western blotting等方法从基因和蛋白水平对外源基因在细胞中的表达情况进行鉴定等方法成功构建和鉴定了10株分别稳定表达甲型H1N1流感病毒聚合酶蛋白PB1、聚合酶蛋白PB2、聚合酶蛋白PA、核蛋白NP和基质蛋白M1的293T转基因细胞株或MDCK转基因细胞株，分别命名为293T-PB1转基因细胞株、293T-PB2转基因细胞株、293T-PA转基因细胞株、293T-NP转基因细胞株、293T-M1转基因细胞株、MDCK-PB1转基因细胞株、MDCK-PB2转基因细胞株、MDCK-PA转基因细胞株、MDCK-NP转基因细胞株和MDCK-M1转基因细胞株。 二、通过体外拯救获得了1株复制缺陷型甲型H1N1流感病毒(毒株命名PB2-D)。以2009年甲型H1N1流感病毒的鼠适应株UI182的感染性克隆为基础，通过点突变的方法分别在感染性克隆的PB1、PB2、PA、NP或M1质粒基因编码区中插入终止子突变，构建了5个复制缺陷型感染性克隆UI182-PB1-D、UI182-PB2-D、UI182-PA-D、UI182-NP-D和UI182-M1-D。将复制缺陷型感染性克隆分别同其余7个未经改造的感染性克隆共转染至相应的293T转基因细胞株中进行复制缺陷型病毒的体外拯救。 结果成功拯救出1株复制缺陷型甲型H1N1流感病毒，并将其命名为PB2-D。通过电镜观察、血凝试验鉴定、RT-PCR鉴定和全基因组测序等方法对PB2-D进行了鉴定。鉴定结果表明，PB2-D具有流感病毒的典型形态，能够凝集鸡红细胞，具有流感病毒表面血凝素的基本特性，PB2-D包含的8个基因节段符合甲型H1N1流感病毒的基因组特征且带有突变标记。 三、复制缺陷型甲型H1N1流感病毒的安全性分析与初步应用。我们分析了复制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D在MDCK细胞、MDCK-PB2转基因细胞、SPF鸡胚以及C57/BL6小鼠中的复制能力。分析结果发现PB2-D仅能在MDCK-PB2转基因细胞中进行复制，并表现出与亲本毒UI182相似的复制特性，然而，PB2-D不能够在MDCK细胞、鸡胚和C57/BL6小鼠体内进行有效复制，以上结果表明复制缺陷型甲型H1N1流感病毒具有良好的安全性。此外，我们成功构建H5亚型和H7亚型的复制缺陷型流感病毒H5-PB2-D和H7-PB2-D并将之应用于流浪犬血清相关抗体的检测，并在流浪犬体内发现H7抗体存在的证据。 四、稳定表达甲型H1N1流感病毒PB2蛋白的转基因小鼠的构建及初步应用。通过原核注射的方式将甲型H1N1流感病毒鼠适应株UI182株的PB2基因转移至小鼠受精卵中。通过PCR扩增对外源基因在子代小鼠基因组中的整合情况进行鉴定，结果显示成功获得雌雄各1只，共2只G0代小鼠，G0代小鼠体内GFP报告基因表达呈阳性。对G1代小鼠体内外源基因表达情况进行RT-PCR和Western blotting分析的结果显示PB2基因在G1代小鼠肺中可以被转录为mRNA并翻译为相应的蛋白。以上结果表明，我们成功构建了表达流感病毒UI182PB2蛋白的转基因小鼠。将复制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D接种该转基因小鼠后，可以于接种后的第3天在转基因小鼠肺内检测到病毒PB2-D的复制，病毒滴度为103.03TCID50/mL，表明复制缺陷型甲型H1N1流感病毒可以在转基因小鼠肺脏中进行复制。 综上所述，本研究成功获得了1株复制缺陷型甲型H1N1流感病毒，并对该病毒的生物学特性和安全性进行了分析。分析结果显示，PB2-D具有流感病毒的典型形态，在稳定表达病毒PB2蛋白的MDCK-PB2转基因细胞中的复制能力与亲本病毒UI182无差异，但PB2-D无法在MDCK细胞、鸡胚和小鼠体内进行复制，上述结果表明本研究构建的复制缺陷型甲型H1N1流感病毒具有良好的生物安全性，其构建策略适用于高致病性流感病毒的体内外相关评价和研究，可为从事研究的人员提供更高的安全保障。此外，为了扩大复制缺陷型甲型H1N1流感病毒的应用范围，我们成功构建了可稳定表达甲型H1N1流感病毒PB2蛋白的转基因小鼠来作为与复制缺陷型甲型H1N1流感病毒配合使用的动物模型。试验结果表明，复制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D能够成功感染该转基因小鼠，并在其肺脏内复制。本课题研究成果对利用复制缺陷型流感病毒开展流感病毒复制、传播、致病机制以及疫苗研发等工作具有重要的指导意义和推进作用。

目录

摘要

1．流感病毒概述

1．1流感病毒的结构

1．2流感病毒的复制

1．3甲型流感病毒蛋白的功能

1．4流感病毒的流行现状

1．5反向遗传技术在流感病毒研究中的应用

2．复制缺陷型病毒概述

2．1复制缺陷型VSV病毒概述和研究进展

2．2慢病毒载体概述和研究进展

2．3腺病毒载体概述和研究进展

3．复制缺陷型流感病毒的研究进展

第二章稳定表达流感病毒PB1、PB2、PA、NP和M1蛋白的293T和MDCK转基因细胞株的构建和鉴定

1．材料

1．1细胞与病毒

1．2菌株及质粒

1．3主要试剂和仪器

2．方法

2．1病毒增殖

2．2病毒RNA提取

2．3病毒基因cDNA合成

2．4真核表达质粒的构建

2．5转基因细胞株的构建

3．实验结果

3．1重组真核表达质粒载体的构建与鉴定

3．2转基因细胞株构建与鉴定

4．讨论

5．小结

第三章复制缺陷型甲型H1N1流感病毒的构建

1．1细胞与鸡胚

1．2菌株及质粒

1．3主要试剂和仪器

2．方法

2．1 UI182 PB1、PB2、PA、NP、M1突变质粒的构建

2．2复制缺陷型流感病毒的体外拯救

3．结果

3．1 UI182 PB1、PB2、PA、NP和M突变质粒的构建与鉴定

3．2病毒体外拯救结果的血凝鉴定

3．3重组流感病毒基因组的RT-PCR鉴定

3．4重组流感病毒的电镜观察

4．讨论

5．小结

第四章复制缺陷型甲型H1N1流感病毒的安全性分析与初步应用

1．材料

1．1细胞和毒株

2．2鸡胚半数感染剂量(EID50)

2．3小鼠半数致死量(MLD50)

2．4发病率(Morbidity)

2．5死亡率(Mortality)

2．6复制缺陷型病毒在体外培养细胞中的复制动力学

2．7复制缺陷型病毒在小鼠体内的复制动力学

2．8血凝抑制抗体效价检测

2．9血清微量中和实验

3．实验结果

3．2 PB2-D在鸡胚中的复制

3．4 PB2-D的遗传稳定性

3．5流浪犬血清样本中流感病毒抗体的检测

4． 讨论

5． 小结

第五章稳定表达流感病毒PB2蛋白的转基因小鼠构建与初步应用

1．材料

1．3仪器

2．方法

2．1重组质粒线性化与纯化

2．2小鼠受精卵的原核注射

2．3子代小鼠的基因型鉴定

2．4复制缺陷型病毒在转基因小鼠体内的复制动力学

3．实验结果

3．1 G0代小鼠的基因型鉴定

3．2报告基因在G0代转基因小鼠体内的表达情况

3．3 G1代小鼠的基因型鉴定与表型分析

3．4流感病毒PB2基因在转基因小鼠体内的表达情况

3．5复制缺陷型病毒在转基因小鼠模型中的复制

4．讨论

5．小结

结论

缩略词

参考文献

博士期间发表的学术论文

致谢

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