轮状病毒动物模型的构建及ZTR--68株灭活轮状病毒疫苗的体内保护性实验

摘要

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原之一，全球每年感染人数近1.1亿，病死数约为50万。至今，仍没有治疗轮状病毒感染的有效药物。疫苗接种是预防轮状病毒感染的有效手段。探究轮状病毒动物模型的构建，不仅有助于评价轮状病毒疫苗的保护性，也有助于研究轮状病毒导致腹泻的机制。 目的：探究Balb/c乳鼠作为不同种属型别的轮状病毒动物模型的可靠性，在此基础上，评价RV灭活疫苗在小鼠模型中的保护作用。 方法：使用具有致病性的人源轮状病毒ZTR-68(G1[P8])株和实验室参考强毒株SA11(G3[2])分别感染Balb/c乳鼠(4d)。实验动物分为6组，ZTR-68与SA11各三个组，感染剂量为：ZTR-68高剂量组9×106PFU/只，中剂量组6×106PFU/只及低剂量组3×106PFU/只;SA11高剂量组1×106PFU/只，中剂量组1×105PFU/只，低剂量组1×104PFU/只。经灌胃途径，依次感染。对照组灌胃同等剂量的PBS缓冲液。攻毒感染后1～7天对乳鼠进行各项指标的观察、收集、检测，以综合分析法评价动物模型的科学性和可靠性。在此基础上，使用ZTR-68毒株制备的灭活疫苗免疫动物后，观察检测评价疫苗的保护性效果。疫苗免疫动物分为160EU（酶标单位）、320EU和640EU三个剂量，经腹腔免疫2针，间隔2周。免疫后的成年鼠进行交配，待分娩后分别检测母鼠与乳鼠体内抗RV特异性抗体。对乳鼠用ZTR-68和SA11毒株攻毒进行保护性试验评价。 结果：ZTR-68及SA11高、中剂量组均可以导致乳鼠发生明显腹泻及排毒，乳鼠攻毒24h后肠道即可见明显病变，于攻毒48h和72h后，乳鼠腹泻持续加重，肠道病变进一步加重。免疫疫苗组乳鼠，经灌胃攻毒后，腹泻发生延迟、腹泻程度降低，乳鼠粪便排毒量减少，肠道病变明显减轻。 结论：人源性RV ZTR-68毒株及猴源RV SA11株均可以用于Balb/c乳鼠动物模型的构建。ZTR-68株制备的灭活疫苗免疫母鼠后产生的抗体可良好的传递给子代乳鼠，传递于乳鼠的抗体不仅能够保护疫苗亲本株的攻击，也能保护SA11毒株的攻击，提示RV灭活疫苗诱导的抗体具有交叉保护作用。

目录

摘要

引言

第一部分轮状病毒抗原的制备

一、实验材料

2、主要试剂及耗材

3、主要仪器

二、实验方法

2、MA104细胞的传代培养

3、轮状病毒的增殖培养

4、病毒蚀斑法测定病毒滴度

5、轮状病毒ZTR-68株和SA11株基因组RNA的提取

6、轮状病毒基因组RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳

三、实验结果

1、轮状病毒的增殖培养

2、轮状病毒滴度的测定

3、轮状病毒基因组RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳

四、讨论

五、小结

第二部分轮状病毒动物模型的构建

一、实验材料

2、主要试剂及耗材

3、主要仪器

二、实验方法

1、乳鼠攻毒

2、样品的收集处理

3、乳鼠临床症状的观察

4、ELISA检测乳鼠粪便中RV抗原量

5、Trizol法提取各组织RNA

6、QPCR检测乳鼠各组织RV含量

7、免疫荧光检测RV抗原在各组织中的分布

8、TUNEL法检测各组织细胞凋亡

三、实验结果

1、乳鼠腹泻观察及腹泻评分

2、ELISA检测乳鼠粪便上清RV抗原量

3、Q-PCR检测各组织RV抗原量

4、免疫荧光检测RV抗原分布

5、病理切片

6、TUNEL检测各组织细胞凋亡

7、电镜观察小肠组织细胞微结构

四、讨论

五、小结

第三部分轮状病毒ZTR-68株灭活疫苗体内保护性实验

一、实验材料

1、实验动物和毒株

2、主要试剂及耗材

3、主要仪器

二、实验方法

1、母鼠免疫

2、Balb／c乳鼠抗体水平检测及感染轮状病毒策略

3、实验样品收集处理

4、ELISA检测乳鼠粪便上清中RV抗原量

5、ELISA检测母鼠与乳鼠血清中抗轮状病毒IgG抗体水平

6、Trizol法提取各组织RNA

7、QPCR检测粪便上清及各组织RV

8、免疫荧光检测RV抗原在各组织中的分布

9、TUNEL法检测各组织细胞凋亡

10、透射电镜观察小肠绒毛细胞病理改变

三、实验结果

1、乳鼠感染轮状病毒后的临床症状及排毒情况

2、QPCR检测乳鼠各组织内RV抗原含量

3、轮状病毒抗原在各脏器中的分布情况

4、TUNEL法检测乳鼠各组织细胞凋亡情况

5、攻毒后乳鼠小肠的病理改变

四、讨论

五、小结

总结

展望

参考文献

致谢

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