强直性脊柱炎患者肠道菌群特征的宏基因组学研究；类风湿关节炎中CD4+ T淋巴细胞亚群TCRβ文库特征研究

摘要

本文从以下几个方面进行论述： 第一部分 强直性脊柱炎患者肠道菌群特征的宏基因组学研究 强直性脊柱炎是一种常见的慢性、系统性、炎症性疾病，属于血清阴性脊柱关节病的一种。这类疾病具有类似的临床症状和病理机制，但又具有各自的特点。强直性脊柱炎以中轴和外周关节炎症、起止点炎症为主要特征。我国汉族人群中发病率在0.2-0.45％。强直性脊柱炎好发于20-30岁的青壮年男性，疾病造成的关节局部疼痛和关节活动能力下降，是直接导致患者社会工作能力减退和生活质量降低的原因，给患者及其家庭带来巨大经济和生活负担。用于治疗强直性脊柱炎的长期药物存在一定的毒副作用，部分药物（如生物制剂类）的昂贵价格更是增加了患者的生活成本和负担。目前，针对强直性脊柱炎发病机制研究证实这是一种由遗传、免疫和环境共同作用的复杂疾病，其具体的发病机制尚不明确。 近年来，肠道菌群被认为是人类免疫系统稳定的重要参与成员。肠道菌群的异常在多种人类疾病中被发现与疾病的发生发展具有密切关系，如2型糖尿病、炎症性肠病及动脉粥样硬化等。近期的研究也发现，肠道菌群的异常可能与强直性脊柱炎的发生存在关联。已有研究发现某些特定的菌种被证实参与了疾病的发生。然而，仅有少量研究对强直性脊柱炎肠道菌群的异常进行系统的描述。 本研究利用宏基因组学的技术，对符合入组标准的85名初治的强直性脊柱炎患者和63名健康对照人群的粪便样本进行了高通量测序，通过对测序序列进行基因比对和分析，从物种和功能两个方面对强直性脊柱炎患者和健康对照的肠道菌群进行了解析，系统的描述了强直性脊柱炎患者肠道菌群的特征，比较了患者和健康对照间的差异，对其可能参与疾病的机制进行了剖析。 我们的研究发现，强直性脊柱炎患者的肠道菌群呈显出与健康对照不同的物种组成模式。在基因的多态性和基因丰度上，强直性脊柱炎患者较健康对照明显降低。对物种组成的分析发现，强直性脊柱炎患者在门、科、种水平的富集状态均与健康对照存在差异。强直性脊柱炎患者主要富集在拟杆菌门，而健康对照则表现出相对丰富的多样性，富集在放线菌门(Actinobacteria);厚壁菌门(Firmicutes);梭杆菌门(Clostridia);变形菌门(Proteobacteria)。在科水平和种水平上，两者的富集模式也与门水平类似，患者集中在类杆菌科（Bacteroidaceae）;瘤胃球菌科(Ruminococcaceae);紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)3个科中。 通过对KEGG通路和模块的分析，我们发现强直性脊柱炎和健康对照在功能基因的分布模式上也存在差异。患者主要功能基因富集于代谢相关通路，而健康对照则相对更为多样。同时，尽管两者的功能基因均在代谢通路上富集，但患者和健康人间再代谢通路的选择上也存在差异，患者富集于脂多糖合成、氨基酸、维生素和辅因子的代谢，而健康对照富集于磷酸戊糖途径相关通路及其他碳水化合物代谢。 此外，我们还利用本研究得到的患者和健康对照mOTU信息，建立了一种基于宏基因组学数据的分类诊断模型。我们从富集的mOTU标记中挑选出13个mOTU标记，根据他们在模型中的重要程度对分类器进行调整和检验，最终得到了一个敏感度和特异度都相对可靠的分类器，可以将强直性脊柱炎与健康对照区分开来。 综上所述，我们的研究系统分析和描述了强直性脊柱炎患者肠道菌群结构和功能的异常情况。我们的实验结果不但揭示了肠道菌群的失调与强直性脊柱炎疾病间的重要关系，还表明这种异常的菌群分布特征可以作为诊断的辅助工具之一。我们的研究成果为解析疾病的发病机制，开发新型诊断手段提供了新的思路和方法，同时也为基于菌群的干预治疗提供了理论基础。 第二部分 类风湿关节炎中CD4+T淋巴细胞亚群TCRβ文库特征研究 类风湿关节炎(RA)是一种严重破坏关节并导致关节畸形的慢性炎症性自身免疫性疾病。该疾病的病理特点包括血清中自身抗体的出现和关节滑膜局部T淋巴细胞和B淋巴细胞的浸润。其中，CD4+T细胞是RA发病机制中最重要的细胞亚群之一。 CD4+T细胞是适应性免疫中的重要组成部分。适应性免疫中最重要的步骤之一就是TCR与抗原的相互识别。人体的免疫系统通过多种方式来对TCR基因的表达进行调控，从而产生足够的具有识别众多外界抗原的多样性的免疫组库。外周血中αβT细胞是主要识别MHC分子提呈的抗原的细胞亚型，这些T细胞的多样性主要由TCR中的第三互补决定区(CDR3)所产生。CDR3基因由V、D、J三个互相分割基因片段构成，他们的重组和排列，是构成CDR3多样性的最重要机制。通过对TCR，尤其是CDR3区域序列的分析，我们可以了解TCR的对抗原识别的情况，尤其是寻找那些可能针对的疾病相关自身抗原TCR克隆。 本研究对类风湿关节炎患者和健康对照外周血中CD4+T细胞各种不同亚群TCRβ链进行了测序和分析。我们对在CDR3的长度和多样性上是否存在差异进行了检测，同时分析了了不同亚群细胞中V-J基因的利用率和克隆亚型。通过对细胞亚群间相似指数的计算，我们分析了亚群间是否存在克隆相似性，并通过Circos图进行展示。最后，我们还对细胞间是否存在公共克隆进行了分析。 我们的研究发现类风湿关节炎患者TCR克隆与健康对照间存在一定差异，尽管我们没有在患者和健康对照间CDR3的多样性上发现明显的差异，但我们观测到在RA患者中出现了Tem和Treg细胞多样性的下降趋势，以及Na(i)ve T细胞的多样性升高趋势。对V-J基因利用情况的分析发现RA患者Th17细胞V-J基因多样性的明显降低。进一步分析发现RA患者中特异的高表达TRBV28 and TRBV3-1克隆亚型。此外我们还发现在细胞亚群TCR克隆的重叠性上，RA患者Th17/Treg表现为与Tem存在明显的相似性，而健康人则表现为与Tcm更为相似。我们还鉴定了一些在Tem细胞和Th17、Treg细胞中共同表达，特异存在于不同患者而非健康人中的TCR克隆，这些克隆的TCR可能识别疾病相关自身抗原的TCR克隆。通过对TCR与临床指标的相关分析，我们发现病程短于2年的患者的TCR克隆表现出与健康人更大的差异，而长病程患者则与健康人相对一致。 综上所述，我们的研究发现类风湿关节炎患者外周血中CD4+T细胞TCR克隆与健康人间存在一定差异。患者中Th17细胞与Tem亚群的相似性可能是类风湿关节炎外周血中高炎症环境的形成的愿意之一。患者间不同细胞亚群中存在的公共克隆提示了疾病中存在一群具有自身反应性TCR克隆的T细胞。我们的研究首次对多种不同CD4+T细胞亚群的TCR组库进行了分析和描述，为进一步解析疾病的发病机制提供了一个新的思路。

目录

中英文缩略词表

第一部分强直性脊柱炎患者肠道菌群特征的宏基因组学研究

摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨论

小结

第二部分类风湿关节炎中CD4+T淋巴细胞亚群TCRβ文库特征研究

摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨论

小结

论文综述肠道菌群在强直性脊柱炎中作用机制的研究进展

参考文献

致谢

附录

声明