昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立研究

摘要

昆虫细胞系具有非常广泛而重要的科学和应用价值。本研究参考动物细胞培养中植块培养的方法，从昆虫幼虫脂肪体细胞的原代培养入手，系统研究了以昆虫脂肪体组织为实验材料建立昆虫细胞系的方法，并初步探讨了昆虫细胞在体外增殖的机制，试图为更多昆虫脂肪体细胞系的建立提供有效的技术手段。研究中选用健康的光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)幼虫脂肪体组织为实验材料进行原代培养，通过比较不同虫龄、不同取材部位的大小和完整性、不同培养表面、不同培养液种类和pH、不同血液中酚氧化酶原抑制物的种类和添加比例、原代培养物的贴壁处理等因素对原代培养结果的影响，以及传代方式、条件、时机等对传代培养结果的影响，试图探索出一套特有的昆虫脂肪体细胞建系方法。实验结果表明，由脂肪体组织建立昆虫细胞系，最佳的取材为末龄或进入预蛹期幼虫体内完整的脂肪体组织，优先使用一次性塑料培养瓶，原代细胞培养液的最佳配制比例为：TNM-FH(80％)，胎牛血清(10％)，苯基硫脲(10％)，pH6.2～6.8。决定昆虫脂肪体细胞是否成系的关键因素包括：原代培养的组织能否同培养器皿表面紧密接触(贴壁)，紧密贴壁的组织块倾向于游离出分裂能力较强的细胞群；在新生细胞长满瓶底时，处理好第一次或前几次转瓶、传代的步骤非常重要。最佳的初次传代方式是轻轻摇晃，将较易脱壁的细胞以较高的密度传入新的培养瓶中，同时注意不要扰动原组织块，减小对细胞的剪切力。原代培养换液量也需要根据细胞的生长状况而定，一般为换液量的50％。 运用上述方法，本研究共建立了7株昆虫幼虫脂肪体细胞系(IOZCAS-Spex-Ⅱ，IOZCAS-Spex-Ⅲ，IOZCAS-Spex-Ⅳ，IOZCAS-Spex-Ⅴ，IOZCAS-Spex-Ⅵ，IOZCAS-Spex-Ⅶ，IOZCAS-Ha-Ⅰ)，其中6株来自甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)，1株来自棉铃虫(Helicoverpaarmigera)。7株细胞系的细胞均以圆形为主；新建立的细胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ和IOZCAS-Ha-Ⅰ的第10代细胞群体倍增时间分别为108.8h和65.2h；IOZCAS-Spex-Ⅱ和IOZCAS-Ha-Ⅰ染色体符合典型的鳞翅目染色体数目较多的特点，多数细胞为多倍体。使用DAF-PCR的方法，鉴定了新建立的细胞系分别来自其同源的昆虫，而与实验室保存的其它昆虫细胞系PCR扩增谱带不同。细胞长期冻存在-80℃的环境下，并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且多次复苏成功。新建细胞系均对同源核型多角体病毒敏感，但敏感程度各不相同，对其它非同源种类的核型多角体病毒不敏感。对已建的细胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ进行了单细胞克隆，当前正在进行放大培养。 使用5'-BrdU掺入法标记了光肩星天牛脂肪体细胞在体内和体外的短期增殖情况，发现该细胞在虫体内增殖缓慢，4d内少有增殖；脂肪体组织在体外贴壁培养后，组织块内部的细胞不增殖，而游离出组织块处于培养液环境中的细胞DNA合成活跃，可以大量增殖。 研究结果表明，选取昆虫末龄幼虫或预蛹完整的脂肪体组织，以物理的手段促使体外培养的组织块紧密接触培养器皿表面，以及小心处理最初几次传代的过程，是利用昆虫脂肪体组织为细胞来源、从原代培养进入到传代培养、最终成功建立细胞系的关键；5'-BrdU掺入法标记初步研究的结果显示，从脂肪体组织块中游离出的细胞，可能是大量分裂增殖而形成细胞系的主要来源，为昆虫细胞体外增殖规律和细胞成系机制的研究，提供新的方法和思路。本文的研究结果为建立新的昆虫细胞系提供技术上的支持和借鉴，也可能使建立新的昆虫细胞系成为一种常规的实验室技术。另外，本研究中新建立的7株具有自主知识产权的鳞翅目昆虫细胞系，不仅丰富了有限的昆虫细胞系资源；而且因其对各自同源的核型多角体病毒敏感，拓展了其研究和应用的价值，可以成为研究昆虫病毒、构建杆状病毒表达载体系统以及大规模生产昆虫病毒杀虫剂的有效工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：正文图表目录

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第一章前言

第二章材料与方法

第三章结果与分析

第四章结论与讨论

参考文献

致谢

附录一试剂配制及仪器型号

附录二专有名词、缩写及昆虫学名

附录三导师简介

附录四作者在读期间发表的学术论文、申请专利情况及参加的科研项目