多年生黑麦草(Lolium perene L.)耐镉机理与LpGCS基因的克隆和功能分析

摘要

重金属污染问题日益突出，对生态环境、食品安全和身体健康构成了严重的威胁，因此，迫切需要对污染的土地进行修复。植物修复法作为一种经济有效和环境友好的方法，具有许多特别重要的优势，然而现存的重金属超富集植物适生范围窄、生长速度慢、生物量小等缺陷而限制了上述技术手段在重金属污染土地中的大规模应用，因而非常有必要选育新的重金属修复植物。多年生黑麦草（Lolium perenne L.）具有地上部分生物量大、根系发达、适应性强的特点(马博英，2010)，因而在用作重金属修复植物资源方面具有非常大的潜力。 因此，本研究拟对多年生黑麦草进行重金属镉处理，以检验多年生黑麦草对镉的抗性和积累特性，并通过施用谷胱甘肽抑制剂BSO，研究了Cd2+和BSO+Cd2+处理下多年生黑麦草的Cd积累特性、生长、生理表现的差异，以期探明影响Cd积累和解毒的关键生理因子，在此基础上，对调控谷胱甘肽合成的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-ECS，又名谷氨酸半胱氨酸连接酶，glutamate cysteineligase，GCS)进行了克隆和功能分析，并建立多年生黑麦草高效组培再生体系，旨在为耐镉、超富集镉的多年生黑麦草新种质的选育奠定基础。 得到的主要结果如下: 1.多年生黑麦草对重金属Cd具有较强的积累能力。对多年生黑麦草进行5、10、20 mg.L-1Cd2+处理6d，Cd2+处理浓度的增加能显著提高多年生黑麦草中Cd的富集水平。20 mg·L-1Cd2+处理下，多年生黑麦草地下部Cd含量达到了6633mg·kg-1DW，地上部Cd含量达到了450.80 mg·kg-1DW，处理6d内，Cd向地上部的转运与Cd2+处理浓度正相关，多年生黑麦草对Cd的富集能力随处理浓度的增加持续增强。多年生黑麦草在Cd2+胁迫下的生物量和根冠比显著降低，生长受到Cd2+的显著抑制。 2.Cd2+胁迫下多年生黑麦草的光合作用受阻。5 mg·L-1Cd2+处理多年生黑麦草6d，叶片净光合速率较对照显著降低，而气孔导度和胞间CO2浓度与对照相比无显著差异。多年生黑麦草叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量未受到Cd2+胁迫显著影响，Cd2+并未抑制光合色素的合成、改变各色素的组成。 3.Cd2+胁迫下多年生黑麦草叶绿素荧光参数的变化。对照与Cd2+处理下，叶片的最大光化学效率和潜在光化学效率无显著变化，然而多年生黑麦草叶片PSⅡ实际光化学效率均随着光合有效辐射强度的增加而逐渐降低，PSⅡ相对电子传递速率均呈先升高后降低的趋势，在高光照强度下（大于580μmol·m-2·s-1），随着辐射强度的增加，实际光化学效率和电子传递速率受Cd2+的显著抑制(P＜0.05)。 多年生黑麦草叶片PSⅡ调节性能量耗散均随着光合有效辐射强度的增加而逐渐升高，在0-1465μmol·m-2·s-1范围内，Cd2+处理下叶片PSⅡ调节性能量耗散始终显著高于对照(P＜0.05);而非调节性能量耗散均显著低于对照。 4.Cd2+胁迫下多年生黑麦草活性氧代谢失衡。Cd2+胁迫下多年生黑麦草根系和叶片中的SOD、APX活性均较对照显著降低，MDA的含量增加，活性氧代谢的平衡被破坏，但其根系和叶片的CAT活性均较对照显著升高，减缓了氧化胁迫的加剧。 5.多年生黑麦草中的GSH与其对重金属Cd的积累有密切关系。Cd2+胁迫下，半胱氨酸、谷胱甘肽、植物螯合肽和总巯基含量显著升高，巯基类化合物的含量与多年生黑麦草中的Cd含量呈正相关。BSO抑制了GSH的合成，使得植物螯合肽和总巯基的含量剧烈下降，这导致了多年生黑麦草中的Cd含量显著降低。 6.获得了GSH合成关键酶基因LpGCS。根据GenBank中已注册的GCS(γ-ECS)基因的CDS序列信息设计简并引物，以多年生黑麦草叶片为材料提取的总RNA为模板，通过RT-PCR和RACE的方法，获得了全长为1674 bp的多年生黑麦草LpGCS基因，该基因包含一个在145-1269bp之间、长度为1125 bp的开放阅读框(Openg reading frame)，它的5'非翻译区和3'非翻译区长分别为144 bp和450bp。多年生黑麦草LpGCS基因在GenBank上的核苷酸序列登录号为KJ551844。 7.成功构建了LpGCS正义和反义表达载体。首先，对基因全长和载体进行酶切位点分析，选择目的基因内部没有相应酶切位点的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点连接到pEASY-T3载体上，构建了pEASY-T3-LpGCS正义和反义载体，然后先后用KpnⅠ和BamHⅠ对含pEASY-T3-LpGCS正义和反义载体、pCAMBIA1301-Ubi载体的质粒进行单酶切，将酶切获得的LpGCS基因的正义和反义小片段分别与pCAMBIA1301-Ubi大片段连接，最终获得正义和反义植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS-。在制备土壤农杆菌感受态细胞后，利用冻融法转化农杆菌，然后转化烟草（Nicotiana tabacum L.），经抗生素筛选、分化与生根，获得了再生的烟草幼苗，结果有待进一步检测。 8.成功建立多年生黑麦草组培再生体系。从不同的品种、消毒方式、外植体类型、外源激素等方面，对影响其愈伤组织诱导、分化与生根的一系列要素进行实验，结果为选择了多年生生黑麦草'高帽2号'饱满胚端半粒颖果作为外植体，在超净台上用75％酒精浸泡1 min，用含有1 ml.L-1的Tween20的次氯酸钠溶液（有效氯含量大于10％）搅拌消毒30 min，无菌水冲洗5次，接种于含5 mg.L-12，4-D和0.025 mg.L-1BAP的MS培养基中有最大愈伤组织诱导率，为68.7％;愈伤组织接种于继代培养基中继代两次后，置于含0.5 mg.L-1NAA、2.0 mg.L-1BAP和0.3 mg.L-1ZT的MS培养基中分化，分化率为56％，最佳生根诱导培养基为1/2MS+ IBA0.1 mg.L-1，再生率为92.8％。 综上所述，本研究明确多年生黑麦草对Cd的积累能力，探明了多年生黑麦草在Cd2+胁迫下的生长、生理响应和GSH在镉富集和解毒中的重要作用，成功克隆了调控GSH合成的关键酶并构建了正义和反义表达载体，经转化后获得了再生的烟草幼苗，并建立了多年生黑麦草高效组培再生体系，这为最终完全确定LpGCS基因功能和获得具有超强重金属抗性和积累能力的多年生黑麦草新的种质资源奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究现状及评述

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 Cd2+胁迫下多年生黑麦草的生长、生理响应

2．1 实验材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验设计

2．1．3 实验方法

2．1．4 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 Cd在多年生黑麦草中的积累特性

2．2．2 Cd2+胁迫对多年生黑麦草生长的影响

2．2．3 Cd2+胁迫下多年生黑麦草的光合生理响应

2．2．4 Cd2+对多年生黑麦草活性氧代谢的影响

2．3 小结

第三章 GSH合成抑制剂对多年生黑麦草抗镉生理的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验设计

3．1．4 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 多年生黑麦草中巯基化合物对Cd2+胁迫的响应

3．2．2 谷胱甘肽合成抑制剂BSO对Cd2+胁迫下多年生黑麦草中巯基化合物含量的影响

3．2．3 谷胱甘肽合成抑制剂BSO对多年生黑麦草Cd积累特性的影响

3．2．4 谷胱甘肽合成抑制剂BSO对Cd2+胁迫下多年生黑麦草气体交换参数的影响

3．2．5 谷胱甘肽合成抑制剂BSO对多年生黑麦草生物量的影响

3．3 小结

第四章 多年生黑麦草LpGCS基因的克隆和序列分析

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 总RNA的提取

4．2．2 反转录

4．2．3 中间片段的获得

4．2．4 RACE法扩增LpGCS基因cDNA全长

4．2．5 序列测定与功能分析

4．3 结果与分析

4．3．1 RNA的纯度和完整性检测

4．3．2 LpGCS中间片段的克隆

4．3．3 LpGCS 5’端的克隆

4．3．4 LpGCS 3’端的克隆

4．3．5 基因全长克隆

4．3．6 LpGCS蛋白同源性分析

4．3．7 LpGCS蛋白质性质与功能预测

4．4 小结

第五章 LpGCS表达载体的构建和转化研究

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 酶与化学试剂

5．1．3 载体与质粒

5．1．4 培养基

5．2 实验方法

5．2．1 正、反义表达载体的构建

5．2．2 农杆菌介导的烟草的转化

5．3 结果与分析

5．3．1 正、反义表达载体的构建

5．3．2 烟草的转化

5．4 小结

第六章 多年生黑麦草再生体系的建立

6．1 实验材料

6．1．1 外植体

6．1．2 化学试剂

6．1．3 培养基

6．2 实验设计

6．2．1 种子生活力测定

6．2．2 适宜品种、外植体消毒和处理方式的筛选

6．2．3 愈伤组织诱导

6．2．4 愈伤组织分化

6．2．5 生根诱导

6．2．6 统计方法

6．3 结果与分析

6．3．1 多年生黑麦草不同品种生活力和活力的比较

6．3．2 适宜品种、外植体消毒方式和类型的筛选

6．3．3 愈伤组织诱导

6．3．4 愈伤组织分化

6．3．5 生根诱导

6．4 小结与讨论

6．4．1 小结

6．4．2 讨论

第七章 结论与讨论

7．1 结论

7．1．1 多年生黑麦草对镉具有较强的积累能力

7．1．2 实际光化学效率和电子传递速率受抑制是多年生黑麦草净光合速率下降的主要原因

7．1．3 Cd2+胁迫下多年生黑麦草抗氧化酶活性显著降低

7．1．4 多年生黑麦草内GSH与其对Cd镉的积累有着重要作用

7．1．5 获得了GSH合成关键酶基因LpGCS

7．1．6 构建了LpCCS正义和反义植物表达载体

7．1．7 成功建立多年生黑麦草组培再生体系

7．2 讨论

7．2．1 多年生黑麦草具有较强镉积累能力原因的探讨

7．2．2 多年生黑麦草中GSH在其对Cd的积累中的作用

7．2．3 多年生黑麦草根和叶中植物螯合肽和谷胱甘肽的含量与变化趋势差异明显

7．3 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢