查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控

摘要

新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)是我国名贵中药材，其主要药用活性成分为黄酮类化合物。目前人们对新疆雪莲及它的黄酮类化合物的需求日益增多，但雪莲的人工栽培技术尚未成熟，在野生状态下，新疆雪莲只能生长在海拔4,000到5,000米的雪山上，现在由于过度采挖已濒临灭绝。为解决雪莲资源匮乏，提高雪莲中黄酮类成分的含量，本研究通过基因工程手段利用发根农杆菌将黄酮代谢途径中的关键酶-查尔酮异构酶(CHI)基因导入新疆雪莲，产生转基因新疆雪莲毛状根及再生苗，以期提高新疆雪莲的黄酮类物质含量，进行新疆雪莲黄酮类物质的生产。主要结果如下：
　　 1.对克隆到的水母雪莲查尔酮异构酶基因(Smchi)进行功能分析。转Smchi正义、反义烟草的CHI酶活性实验结果表明，转Smchi正义的烟草CHI酶活性比对照提高3-6倍，而转反义Smchi基因的烟草CHI酶活性比对照则显著降低。分析不同株系的转基因烟草和对照烟草的黄酮含量和花色素含量表明，转Smchi正义的烟草积累比对照显著增高水平的总黄酮，其中株系CS-5黄酮含量是对照的6倍，转Smchi反义的烟草则积累较低水平的总黄酮，而且转基因烟草的总黄酮含量与Smchi基因的表达水平和CHI酶活性成正相关。但不论转Smchi基因正义或反义方向的烟草，其花色素含量和对照相比均没有发生显著变化。进一步对转基因烟草的黄酮成分进行分析，发现烟草中的主要黄酮成分芦丁在转Smchi正义烟草中有很高的积累。
　　 2.发根农杆菌介导法将Smchi基因导入新疆雪莲，得到转Smchi基因的新疆雪莲毛状根。实验发现，35S-chi转基因对毛状根的生长没有显著影响，但35S-chi转基因毛状根能够合成显著提高水平的芹菜素和总黄酮，其中根系C46经过35 d培养，能产生32.1 mg/L的芹菜素和647.8 mg/L的总黄酮，分别是对照根系的12倍和4倍；不同根系的Smchi基因表达水平、CHI酶活性和芹菜素含量成正相关。本研究为通过基因工程手段提高新疆雪莲毛状根芹菜素和总黄酮含量提供了一个有效方法。
　　 3.在1/2MS附加GA1.5 mg/L的培养基上，新疆雪莲毛状根的不定芽再生频率高且不定芽生长健壮。再生苗在MS+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养基上继代培养生长量较大，经过20 d的培养，35S-chi转基因新疆雪莲再生苗株系(C17、C27、C46)、对照再生苗(Control-1)和正常试管苗(Control-2)之间生长量差异不显著，增殖倍数都在7倍左右；实验还发现，毛状根再生苗比各自来源的毛状根的芹菜素和总黄酮含量下降了20-30％，但转基因再生苗的芹菜素和总黄酮含量比Contro1-1和Control-2都有显著提高，其中C46芹菜素和总黄酮含量分别为1.86 mg/g干重和37.3 mg/g干重，分别是Control-1的12倍和2.4倍，Control-2的4倍和1.6倍。这些结果表明由毛状根诱导出的再生苗可作为增强目标次生代谢产物生产的另外一个有效来源。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1类黄酮化合物的结构、性质及生理活性

1.1类黄酮化合物的基本结构及分类

1.2类黄酮化合物的性质

1.3类黄酮化合物的生理活性及药效

1.4国内外黄酮类化合物的开发

2植物类黄酮次生代谢调控的研究进展

2.1类黄酮生物合成的基本途径及代谢调控

2.2 查尔酮异构酶基因的研究现状

3新疆雪莲研究进展

3.1雪莲的种类与分布

3.2 新疆雪莲的植物学特性及生长环境

3.3 新疆雪莲的主要化学成分

3.4 雪莲花的药理研究

3.5 新疆雪莲的临床研究

3.6新疆雪莲组织培养研究

4本研究的意义与技术路线

4.1 研究背景

4.2本研究目的、意义

4.3 技术路线

第二章Smchi基因的生物活性分析

第一节引言

第二节材料与方法

1 实验材料

2实验方法

第三节结果与分析

1 转正义、反义Smchi基因烟草的总黄酮和花色素含量分析

2 转正义、反义Smchi基因烟草的RT-PCR和CHI酶活性分析

3转正义、反义Smchi基因烟草的芦丁含量分析

第四节讨论

第五节小结

第三章Smchi基因转化新疆雪莲毛状根提高黄酮类物质合成的研究

第一节 引言

第二节材料与方法

1实验材料

2 实验方法

第三节结果与讨论

1 水母雪莲查尔酮异构酶基因(Smchi)的植物表达载体构建

2 电激法将pCAMBIA11301-chi转化到发根农杆菌R1601

3转Smchi基因新疆雪莲毛状根根系的获得

第四节小结

第四章新疆雪莲毛状根不定芽的诱导及再生苗黄酮类物质生物合成研究

第一节 引言

第二节材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三节结果与讨论

1 新疆雪莲毛状根不定芽的诱导及再生苗的培养

2 再生苗的PCR检测

3 35S-chi转基因对新疆雪莲植株生长的影响

4新疆雪莲再生植株的芹菜素和总黄酮含量的测定

5再生植株的生根培养和移栽

第四节小结

结论及下一步的工作设想

参考文献

致谢

个人简历