具有自由基氧化切割机理的人工核酸切割试剂的设计合成、表征及生物活性研究

摘要

人工核酸切割分子，又称人工核酸酶，是用化学方法合成的一类能模拟天然核酸酶断裂核酸骨架的功能小分子。它可以发展成为有用的分子生物学工具和基因治疗药物。本文设计合成了一系列以自由基氧化为核酸切割机理的人工核酸断裂分子，通过多种实验手段研究了它们与核酸间的结合、断裂等生物活性。
　　 本文选用对核酸碱基具有特异性识别能力的寡聚酰胺体系作为人工核酸切割试剂的识别部分，选用具有典型的自由基氧化断裂核酸机理的抗坏血酸(Vc)和吩嗪-5，10-二氮氧化物作为核酸切割体系，通过不同结构柔性手臂连接构成一系列新型核酸切割分子。利用寡聚酰胺对核酸的特异性识别能力，提高和增强切割分子对核酸断裂的选择性及位点专一性。采用化学合成的方法对上述新型切割分子进行合成及结构表征。
　　 在人工核酸切割分子对核酸的生物活性研究中，本文首先利用琼脂糖凝胶电泳的方法对比研究了抗坏血酸(Vc)和通过寡聚酰胺修饰后的新型核酸断裂试剂寡聚酰胺-抗坏血酸的缀合物(ImPyImPy-γ-Vc)对核酸断裂作用的差异。实验结果表明，经寡聚酰胺系统修饰后的抗坏血酸切割分子(ImPyImPy-γ-Vc)在相同条件下与抗坏血酸分子(Vc)相比对核酸的断裂能力明显增强，并可以通过双链切割的模式将质粒DNA断裂为线性DNA。此外，利用模型分析得知，抗坏血酸(Vc)对核酸具有较明显的随机性双链断裂能力，通过寡聚酰胺对抗坏血酸分子的修饰，将其对核酸的作用过程转变为有选择性的非随机性双链断裂。
　　 在人工核酸切割分子与核酸结合能力的研究中，本文利用紫外吸收光谱对经寡聚酰胺修饰前后的抗坏血酸分子对核酸的结合能力进行了研究。实验结果表明，寡聚酰胺系统的引入，使得经其修饰后的抗坏血酸分子(ImPyImPy-γ-Vc)能够以沟渠式结合的模式结合核酸，增强了抗坏血酸分子对核酸的亲和力，这也是改变其切割模式的基础。
　　 此外，本文还合成了经寡聚酰胺修饰的吩嗪-5，10-二氮氧化物的新型人工核酸切割试剂，并进行了相关的化学结构表征。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语说明

声明

第一章前言

1.1人工核酸酶的简介

1.1.1人工核酸酶的研究意义

1.1.2人工核酸酶的组成

1.2人工核酸酶中识别系统的研究进展

1.2.1寡聚核苷酸

1.2.2多肽核酸(PNA)

1.2.3胍基核酸(DNG)

1.2.4可与DNA结合的蛋白以及多肽

1.2.5寡聚酰胺

1.3人工核酸酶中切割系统的研究进展

1.3.1具有自由基氧化切割机理的核酸切割试剂

1.3.2具有酯水解切割机理的核酸切割试剂

1.3.3具有消除机理的核酸切割试剂

1.4本论文的设计思路及创新点

第二章实验部分

2.1仪器

2.2试剂和药品

2.3寡聚酰胺-抗坏血酸(ImPyImPy-γ-Vc)的设计合成

2.4寡聚酰胺-抗坏血酸(Vc-β-Py4-γ-Dp)的设计合成

2.5寡聚酰胺-吩嗪二氮氧化物(Py4-γ-Phenazine di-N-oxide)的设计合成

2.6人工核酸切割试剂ImPyImPy-γ-Vc及其衍生物的生物活性测试

2.6.1贮存液的配制

2.6.2核酸切割实验通法

2.6.3琼脂糖凝胶电泳条件

2.6.4紫外光谱滴定实验通法

2.6.5人工核酸切割试剂ImPyImPy-γ-Vc及其衍生物切割核酸的电泳实验

2.6.6紫外滴定实验

第三章实验结果分析与讨论

3.1关于合成部分的讨论

3.1.1关于寡聚酰胺-抗坏血酸缀合物(Vc-β-Py4-γ-Dp)连接手臂的选择

3.1.2关于2-氯吩嗪合环反应的讨论

3.1.3关于2-氯吩嗪-5，10-二氮氧化物连接手臂反应的讨论

3.2关于生物活性实验部分的讨论

3.2.1关于人工核酸切割试剂(ImPyImPy-γ-Vc)的DNA断裂模式的讨论及其数值分析

3.2.2关于抗坏血酸分子及人工核酸切割试剂(ImPyImPy-γ-Vc)对DNA断裂机理的讨论

第四章结论及展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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