PMB亲和介质用于生物制品中内毒素去除的研究

摘要

生物制品大多是由革兰氏阴性菌表达制备的，内毒素含量通常很高，为保证生物制品使用的安全性，必须加以去除。百日咳疫苗是由百日咳杆菌表达制备的，原料液中内毒素含量极高，经过一步离子交换层析虽可去除其中95％以上的内毒素，但其残留的内毒素含量仍然很高，必须设法去除。本文将合成的多粘菌素B(PMB)亲和介质用于生物制品中内毒素的去除，探索了介质特性、溶液环境、蛋白质特性和操作条件对内毒素去除和蛋白质回收的影响规律，建立了高效的内毒素去除工艺。
　　 首先以琼脂糖凝胶为基质，PMB为亲和配基，合成了PMB QZTFF亲和介质，考察了环氧活化试剂、偶联反应pH值和偶联反应中PMB的加入量对介质合成的影响，建立了间隔臂长度可调、配基密度可控的PMB亲和介质合成方法。
　　 在此基础上，将所制备的介质用于去除不同蛋白质溶液中的内毒素，并重点考察了介质特性、溶液环境、蛋白质特性和操作条件对内毒素去除和蛋白质回收的影响。结果表明配基密度、pH值、盐浓度和蛋白质特性(等电点和疏水性)对内毒素去除效果均有重要影响。pH通过改变各分子的带电性质影响分子间的静电作用，进而影响内毒素的去除和蛋白质的回收，盐浓度的改变则会同时影响分子间的静电作用和疏水作用，而蛋白质的等电点和疏水性是影响蛋白质回收的主要因素。在优化的条件下，血红蛋白、人血清白蛋白和溶菌酶的回收率分别达到87.2％、73.4％和97.3％，相应的内毒素去除率分别达到99.8％、97.9％和99.7％。
　　 在前述实验的基础上，进行百日咳疫苗中内毒素的去除研究，重点考察介质性质(间隔臂长度、配基密度)、溶液环境(pH值、盐浓度、添加剂等)、操作条件和百日咳疫苗制备工艺的衔接方式对百日咳疫苗中内毒素去除及疫苗回收的影响，建立了合适的内毒素去除工艺。在优化的条件下，内毒素去除率可达99％以上，蛋白质回收率为50％～70％，PT回收率可达到40％～60％，FHA回收率可达到55％～75％。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2内毒素概况

1.2.1内毒素的结构和性质

1.2.2内毒素的检测方法

1.3内毒素的去除方法

1.3.1非选择性方法

1.3.2层析法

1.3.3选择性方法

1.3.4前景展望

1.4百日咳疫苗

1.5课题设计思想及难点分析

1.5.1课题设计思想

1.5.2难点分析

第二章多粘菌素B亲和介质的制备

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1化学试剂

2.2.2实验设备

2.3实验方法

2.3.1琼脂糖凝胶4FF的环氧活化反应

2.3.2偶联配基反应

2.3.3封闭反应

2.4分析方法

2.4.1环氧基密度测定

2.4.2反相色谱分析PMB浓度

2.4.3凯氏定氮法测定配基密度

2.5实验结果与讨论

2.5.1环氧活化

2.5.2 PMB配基偶联

2.6小结

第三章PMB亲和介质用于去除不同蛋白质溶液中的内毒素

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1化学试剂

3.2.2实验设备及仪器准备

3.3实验方法

3.3.1储备液配制

3.3.2内毒素吸附

3.4分析方法

3.4.1内毒素检测

3.4.2蛋白质浓度检测

3.5实验结果及讨论

3.5.1 正交实验

3.5.2溶液环境对不同体系中内毒素去除的影响

3.5.3其它因素对水溶液中内毒素去除的影响

3.6小结

第四章百日咳疫苗中内毒素的去除

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1化学试剂

4.2.2实验设备及仪器

4.3实验方法

4.3.1离子交换层析

4.3.2亲和吸附

4.4分析方法

4.4.1内毒素检测

4.4.2蛋白质浓度测定

4.4.3 PT和FHA活性检测

4.5实验结果及讨论

4.5.1介质特性的考察

4.5.2溶液环境的考察

4.5.3操作条件的考察

4.5.4工艺放大

4.6小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

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