利用不同启动子在大肠杆菌与肺炎克协伯氏菌中合成PQQ的研究

摘要

吡咯喹啉醌(PQQ)是参与氧化还原反应的辅因子，作为许多酶的辅酶，如脱氢酶，氧化酶，水合酶与脱羧酶。PQQ含有能直接参与氧化还原反应的邻醌类结构，以上酶蛋白可以催化非磷酸化的底物发生氧化反应，如醇类，醛类和醛糖类。此外，PQQ还被认为是继吡啶和核黄素之后的第三类参与氧化还原反应的辅因子。
　　 限已知与PQQ合成相关的基因有7个，在生物体内通常成基因簇。功能相近的基因具有一定同源性，并按一定顺序排列为pqq基因簇。肺炎克雷伯氏菌中， PQQ基因簇为一段pqqABCDEF的连续基因，约7Kb。本实验以肺炎克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae DSM2026)编码PQQ基因簇作为模板，本实验克隆了肺炎克雷伯氏菌中5.5kb的PQQ合成基因簇pqqABCDEF，利用不同启动子，分别以大肠杆菌与肺炎克雷伯氏菌为宿主生物合成PQQ。采用NBT（氧化型）-甘氨酸钾溶液非酶系统测定PQQ含量。并利用无细胞体系原理用细胞破碎液合成PQQ。实验结果表明启动子影响PQQ合成，通过培养基的优化产量达到约1700nM。同时无细胞体系结果为PQQ体外合成提供依据。
　　 同时提取大肠杆菌BL21基因组，设计引物得到葡萄糖脱氢酶序列，构建重组BL21大肠杆菌工程菌。IPTG诱导表达，并经过葡萄糖与Mg离子优化培养基，SDS-PAGE检测结果显示PQQGDH得到高效表达。

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摘要

第一章 绪论

1．1 PQQ的发现

1．2 PQQ的物理性质

1．3 自然界PQQ的分布

1．4 PQQ在生物体中功能

1．4．1 PQQ参呼吸链电子传递

1．4．2 PQQ是刺激机体的生长因子

1．4．3 修复受损神经细胞

1．4．4 其他生理作用

1．5 对PQQ的生物合成途经的研究

1．6 PQQ的合成基因

1．6．1 pqqA

1．6．2 pqqB

1．6．3 pqqC与pqqD

1．6．4 pqqE基因

1．6．5 pqqF和pqqG

1．6．6 PQQ基因产物的结构图

1．7 PQQ的生物合成调控

1．8 本课题的立项意义

第二章 不同启动子的PQQ工程菌构建

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 试剂与仪器

2．2．3 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 肺炎克雷伯氏杆菌基因组的提取

2．3．2 聚合酶链式反应(PCR)扩增pqq 5．5kb片段

2．3．3 聚合酶链式反应扩增不同启动子片段

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收启动子片段与目的基因pqq 5．5K片段

2．3．5 提取pET-28a质粒

2．3．6 不同启动子质粒的构建

2．3．7 重组质粒转化大肠杆菌

2．3．7 利用菌落PCR进行阳性克隆筛选

2．3．8 启动子质粒双酶切鉴定

2．3．9 不同启动子的PQQ重组质粒构建

2．3．6 重组质粒转化大肠杆菌

2．3．11 利用菌落PCR进行阳性克隆筛选

2．3．12 转化肺炎克雷伯氏菌k．p 1st

2．4 结果与讨论

2．4．1 K．pneumoniae subsp．Pneumoniae基因组提取产物鉴定

2．4．6 5．5KPQQ基因簇PCR扩增

2．4．3 pET28a质粒

2．4．4 目的启动子的鉴定

2．4．5 启动子片段菌落PCR

2．4．7 构建重组菌后进行菌落PCR

2．5 本章小结

第三章 重组工程菌表达PQQ的研究

3．1 引言

3．1．1 利用非酶系统测定样品中的PQQ含量

3．1．2 不同启动子的工程菌PQQ产量的检测

3．2 实验材料

3．2．1 菌株与质粒

3．2．2 试剂与仪器

3．2．3 培养基

3．2．4 培养条件

3．2．5 PQQ产量检测

3．3 结果与讨论

3．4 本章小结

第四章 土壤中筛选PQQ生产菌方法的建立

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 培养基

4．2．3 培养条件

4．2．5 PQQ产量检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 土样采集

4．3．2 菌株初筛

4．3．3 菌株复筛

4．4．4 PQQ产量检测

4．4．5 菌株鉴定

4．5 本章小结

第五章 构建大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因工程质粒

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 菌株与质粒

5．2．2 试剂与仪器

5．2．3 培养基

5．3 实验方法

5．3．1 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21基因组DNA的提取

5．3．2 扩增葡萄糖脱氢酶基因

5．3．3 DNA电泳鉴定目的基因gcd片段并回收

5．3．4 pET-22b质粒载体的提取

5．3．5 酶切并且连接

5．3．6 转化

5．3．7 菌落PCR确定阳性克隆

5．3．8 pET22b-gcd的酶切鉴定

5．4 结果与讨论

5．4．1 Escherichia coli BL21基因组DNA的提取

5．4．2 gcd基因片段PCR扩增

5．4．3 pET22b质粒提取

5．4．4 酶切，连接和转化

5．4．5 菌落PCR

5．4．6 质粒单酶切与双酶切鉴定

5．5 本章小结

第六章 重组质粒的工程菌表达葡萄糖脱氢酶的研究

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 菌株与质粒

6．2．2 试剂与仪器

6．2．3 培养基

6．3 实验方法

6．3．1 SDS-PAGE鉴定重组蛋白

6．3．2 pET28a-gcd工程菌的表达条件优化

6．4 结果与讨论

6．4．1 SDS-PAGE检测分析PQQGDH

6．5 小结

第七章 实验总结与建议

7．1 主要结论

7．2 本文创新点

7．3 问题与建议

第八章 干扰素缺陷型细胞系构建(第四年联合培养实验)

8．1 引言

8．2 实验材料

8．3 实验方法

8．4 实验结果及讨论

参考文献

附录1 试剂

附录2 仪器设备

致谢

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