生物法生产N-乙酰氨基葡萄糖

摘要

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的氨糖，在人体及微生物等各类生物中发挥着重要作用，被广泛应用于食品、药品及化妆品行业。目前GlcNAc以化学法生产为主，但是化学法的主要原料是虾蟹等甲壳类动物的外骨骼，这类原料存在产地和季节的限制等问题，同时化学法生产GlcNAc过程中会造成比较严重的环境污染。出于这些限制因素的考虑，用生物法合成GlcNAc成为一种新选择。生物法合成GlcNAc的原料一般以生物质为主，且生产过程对环境污染小，具有较大优势。
　　本文选用了谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）为对象进行代谢路径改造合成GlcNAc。本论文的主要目的是通过对GlcNAc合成途径的优化来提高Corynebacterium glutamicum ATCC13032GlcNAc产量。本论文主要进行了以下工作:
　　(1)通过过表达基因glnA对谷氨酸棒状杆菌代谢途径中加强谷氨酰胺合成途径表达，增强GlcNAc氨基供体谷氨酰胺合成，重组菌C.gW-SG的GlcNAc产量达到2.34g/L。通过敲除基因poxB对副产物乙酸合成途径阻断并将GlcNAc合成途径中关键酶基因GNA1进行整合，重组菌C.gWBG-SGA的GlcNAc产量达到2.62g/L。
　　(2)通过对GlcNAc途径主要竞争途径中的关键基因pfkA进行弱化，采用了anti-sense RNA和CRISPRi两种方式进行。弱化效果最好的是通过anti-sense RNA进行弱化的菌株C.gWBG-SGAA1的GlcNAc产量达到3.11g/L。
　　(3)确定了菌株C.gWBG-SGAA1发酵过程中诱导剂最优添加时间和添加浓度分别为接种后2h和0.8mM IPTG。对发酵培养基中重要成分进行浓度优化，当葡萄糖浓度为85g/L，玉米浆浓度为40g/L，尿素浓度为5g/L时最为合适，菌株C.gWBG-SGAA1达到4.48g/L。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．2 N-乙酰氨基葡萄糖生产方法国内外研究进展

1．2．1 化学法合成N-乙酰氨基葡萄糖

1．2．3 微生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖

1．3 N-乙酰氨基葡萄糖代谢途径分析

1．3．1 GlcNAc合成模块

1．3．3 菌株代谢过程中目的产物主要竞争途径

1．4．1 谷氨酸棒状杆菌中GlcNAc合成模块优化

1．4．2 谷氨酸棒状杆菌中主要竞争途径弱化

1．4．3 谷氨酸棒状杆菌发酵培养基中重要成分优化

1．5 课题的研究意义

1．6 课题的研究思路

1．6．1 研究内容

1．6．2 研究方案

第二章 谷氨酸棒状杆菌代谢通路优化合成GlcNAc

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 培养基、引物、酶及实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法与分析条件

2．3．1 菌体培养条件及代谢物和产物检测方法

2．3．2 质粒构建方法

2．3．3 谷氨酸棒状杆菌的转化与筛选

2．3．4 谷氨酸棒状杆菌基因敲除方法

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 N-乙酰氨基葡萄糖底物积累途径的强化

2．4．2 丙酮酸脱氢酶基因poxB敲除及六磷酸氨基葡萄糖乙酰转移酶基因GNA1整合

2．5 本章小结

第三章 谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc关键基因调控

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 菌株与质粒

3．2．2 培养基、引物、酶及实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法与分析条件

3．3．1 菌体培养条件及代谢物和产物检测方法

3．3．2 质粒构建方法

3．3．3 谷氨酸棒状杆菌的转化与筛选

3．3．4 谷氨酸棒状杆菌基因弱化方法

3．3．5 菌体mRNA水平检测方法

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 Anti-sense RNA弱化关键基因pfkA

3．4．2 CRISPRi弱化关键基因pfkA

3．5 本章小结

第四章 谷氨酸棒状杆菌生产GlcNAc发酵培养基重要成分优化

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 菌株

4．2．2 培养基

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法与分析条件

4．3．1 菌体培养条件及代谢物和产物检测方法

4．3．2 发酵过程中诱导条件优化

4．3．3 发酵培养基中关键组分浓度优化

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 诱导条件优化

4．4．2 发酵培养基中关键组分浓度优化

4．4 实验小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

作者及导师介绍简介