PI3K/AKT信号通路在1,25-二羟基维生素D3联合远端缺血预处理在抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用机制

摘要

目的：　　利用SD大鼠构建Nauta法70%阻断肝脏缺血再灌注模型，观察1,25-二羟基维生素D3(以下简称为维生素D3)进行药物预处理与远端缺血预处理在抗肝脏缺血再灌注损伤中有无防护作用，以及两者联合使用时，是否能使这一防护作用得以加强。同时，通过测定Akt、p-Akt的蛋白表达水平，在分子层面上，研究PI3K/Akt信号通路与抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤的关系，以及1,25-二羟基维生素D3与远端缺血预处理联合应用时，在抗肝脏缺血再灌注损伤中是否存在着协同作用，为联合应用维生素D3与远端缺血期处理来应对肝脏缺血再灌注损伤而提供理论基础。　　方法：　　将48只健康雄性SD大鼠(280±20g)随机分为假手术组(Sham组，8只)、对照组(NS组，8只)、实验组(32只)。其中实验组又可以分成4组，每组8只，分别是远端缺血预处理组(RIPC组)、维生素D3组(VD组)、远端缺血预处理+维生素D3组(RIPC+VD组)、远端缺血预处理+维生素D3组+Ly294002组(LY组)。治疗组中的VD组、RIPC+VD组、LY组，于术前两周开始，隔天通过腹腔注射浓度为0.01ug/ml的1,25-二羟基维生素D3，每次注射量为1ml/kg；Sham组、NS组和RIPC组分别于术前两周隔天通过腹腔注射生理盐水，每次注射量为1ml/kg。另外，治疗组中的LY组在手术前30分钟以1.5mg/kg的剂量向尾静脉注射1ml含有LY294002(PI3K阻滞剂)的二甲基亚砜(DMSO)溶液。　　除假手术组(Sham组)以外，对照组和治疗组均采用国内外广泛认可的Nauta法建立了经典的70%肝脏缺血再灌注动物模型，每组再灌注后6小时取下腔静脉血液和肝组织作为试验标本。其中：　　1.通过对各组大鼠血清中ALT、AST含量进行检测，从而评估其肝功能。　　2.运用WesternBlot法检测各组中Akt蛋白、p-Akt蛋白的表达量。　　3.通过对肝脏切片进行HE染色，来观察各组中肝组织形态学变化。　　4.运用免疫组化来观察各组标本中Akt蛋白、p-Akt蛋白的阳性表达情况。　　5.通过对标本进行TUNEL染色，观察并计算肝细胞的凋亡指数。　　结果：　　1.与Sham组比较，各组血清ALT、AST水平均有升高，其中NS组升高最明显(P＜0.05)；与NS组比较，RIPC组、VD组、RIPC+VD组血清ALT、AST水平均明显降低(P＜0.01)，尤以RIPC+VD组下降得最为明显；RIPC组血清ALT、AST水平稍低于VD组(P＜0.05)。与NS组比较，加入抑制剂的LY组血清ALT、AST水平稍低(P＜0.05)，但稍高于VD组(P＜0.05)。　　2.HE染色病理切片见，除了Sham组外，各组肝细胞均有不同程度的肿胀。其中以NS组肿胀最为明显，大量肝细胞破裂坏死，肝窦结构严重破坏。LY组较NS组稍好，肝细胞核萎缩、深染、碎裂减少，但肝细胞排列紊乱，胞质可见水样变性，肝窦周围有炎症细胞浸润。RIPC组、VD组两者HE病理切片结果类似，表现优于NS组与LY组，仅见少量肝细胞核萎缩碎裂，肝细胞偶尔可见排列紊乱，胞质可见水样变性，肝窦周围有炎症细胞浸润。与以上各组(Sham组除外)比较，RIPC+VD组表现最好，肝细胞结构仍清晰，仅见部分肝细胞变性，水样变性程度也较轻，仅有少量的炎性细胞浸润。　　3.Westernblot检查结果：(1)Akt蛋白检测结果：各组Akt蛋白阳性表达的细胞数量均比Sham组有减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。与RIPC+VD组和LY组相比，NS组、RIPC组、VD组Akt蛋白阳性表达的细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，但NS组、RIPC组、VD组之间，两两比较无统计学意义(P＞0.05)。RIPC+VD组和LY组之间，LY组比RIPC+VD组稍减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)p-Akt蛋白检测结果：各组p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量比Sham组明显增多，差异有统计学意义(P＜0.01)；RIPC组、VD组、RIPC+VD组p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量较NS组增多，差异有统计学意义(P＜0.05)，但RIPC组、VD组、RIPC+VD组之间两两相比较：RIPC组稍高于VD组，但两者之间无明显统计学意义(P＞0.05)；RIPC+VD组稍高于RIPC组，两者之间也无明显统计学意义(P＞0.05)；RIPC+VD组高于VD组，两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。而LY组与NS组相比，LY组p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量稍低于NS组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。LY组与VD组相比，LY组p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量低于NS组，但差异有统计学意义(P＜0.05)。　　4.免疫组化检查结果：(1)Akt蛋白表达于肝细胞质内为主。与Sham组比较，各组Akt蛋白阳性表达的细胞数量均比Sham组有减少。与RIPC+VD组相比，LY组、NS组、RIPC组、VD组Akt蛋白阳性表达的细胞数量明显减少，但LY组、RIPC组、VD组之间，两两比较无明显差别。与LY组、RIPC组、VD组相比，NS组肝细胞阳性表达的数量明显减少。(2)p-Akt蛋白表达于肝细胞核为主。与Sham组相比较，各组肝脏组织的p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量均明显增多；与NS组比较，RIPC组、VD组、RIPC+VD组p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量较NS组稍多，但差距并不明显；RIPC组、VD组、RIPC+VD组之间两两相比较：RIPC组与VD组，但两者之间肝脏组织的p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量无明显区别，但均低于RIPC+VD组；与NS组比较，LY组肝脏组织p-Akt蛋白阳性表达的细胞数量则较NS组稍减少；与RIPC组、VD组比较，LY组肝脏组织的p-Akt蛋白阳性表达细胞数量稍减少。　　5.与Sham组比较，各组肝脏细胞凋亡指数均有不同程度的升高(P＜0.05)；其中NS组凋亡指数最高(P＜0.01)；VD组肝脏细胞凋亡指数稍低于LY组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；RIPC组肝脏细胞凋亡指数比VD组稍降低(P＜0.05)；RIPC+VD组肝脏细胞凋亡指数又比RIPC组要低(P＜0.05)。　　结论：　　1.远端缺血预处理和维生素D3在肝脏的缺血再灌注损伤过程中均能发挥保护的作用，且远端缺血预处理的效果稍优于维生素D3。　　2.将远端缺血预处理和维生素D3联合应用，与单一运用相比，能显著增强对肝脏的缺血再灌注损伤过程中的保护作用。　　3.远端缺血预处理和维生素D3可能通过激活PI3K/Akt信号通路，诱导其下游FoxO蛋白磷酸化，减少肝缺血再灌注损伤中的肝细胞凋亡。　　4.除了通过激活PI3K/Akt信号通路来减少肝缺血再灌注损伤中的肝细胞凋亡外，远端缺血预处理和维生素D3还存在其他减少肝缺血再灌注损伤的途径。

目录

声明

1.前言

1.1 肝脏外科与HIRI

1.2 远端缺血预处理（RIPC）

1.3 1,25-二羟基维生素D3

1.4 PI3K/AKT信号通路

1.4.1 通路的组成

1.4.2 通路的激活

1.4.3 通路的调控

2.1 材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验药品

2.1.3 主要实验器材和试剂

2.2 方法

2.2.1 大鼠分组

2.2.2 建立肝脏缺血再灌注动物模型

2.2.3 实验标本处理和指标检测

2.2.4 统计学分析

3. 实验结果

3.1 复流6h后，大鼠门静脉血清中ALT 、AST的结果

3.1.1 各组大鼠血清 ALT结果

3.1.2 各组大鼠血清AST结果

3.2 Western Blot结果

3.2.1复流6h后，大鼠肝组织中Akt结果

3.2.2 p-Akt 蛋白表达

3.3 光学显微镜下肝细胞病理改变

3.4 免疫组化IHC结果

3.4.1 Akt蛋白IHC结果

3.4.2 p-Akt蛋白IHC结果

3.5 TUNEL染色及肝细胞凋亡指数计算结果

4. 讨论

5.结论

6.不足与展望

参考文献

缩略词表

在校期间论文清单

致谢