江浙蝮蛇毒IX因子结合蛋白（AHP IX-bp）和尖吻蝮蛇毒锌金属蛋白酶AaH IV自降解产物D/C-motif(acucetin)的结构和功能关系研究

摘要

1、蝮蛇毒IX因子结合蛋白(AHP IX-bp)的纯化、生化性质鉴定、cDNA序列测定、晶体生长和结构分析研究 AHP IX-bp是从江浙蝮蛇毒中纯化得到的一种新的凝血因子IX结合蛋白,是由一对二硫键连接的异源二聚体,分子量为25kDa左右,A亚基的分子量为15.5kDa,B亚基的分子量为15kDa.测定了AHP IX-bp的N-端氨基酸残基序列以及它的部分cDNA序列.序列比较结果显示,AHP IX-bp和其它蛇毒C-型凝集素类似蛋白的序列同源性很高,并且AHP IX-bp能结合IX因子,不能结合X因子,因此AHP IX-bp是一种从蛇毒中分离得到的新的IX因子结合蛋白.比较AHP IX-bp和其它蛇毒来源的IX/X因子结合蛋白的氨基酸序列显示,IX/X因子结合蛋白序列主要的有效的差别在A56-A67,这一区域的氨基酸残基的差别可能与IX/X因子结合蛋白识别配体的差异性相关.AHP IX-bp与IX因子的结合具有锌离子和pH依赖性,在中性或弱碱性条件下,AHP IX-bp与IX因子的结合能力比弱酸性条件下强得多.为了阐明AHP IX-bp和IX因子结合具有pH依赖性的机理,分别在pH6.5和7.5条件下进行AHP IX-bp的晶体生长实验,获得了可用于X-射线衍射的单晶,并分别收集了2.0A和1.8A的衍射数据.用分子置换法解决了相位问题,测定了AHP IX-bp在两种不同pH条件下的结构.在pH6.5和7.5两种结晶条件下,AHP IX-bp的整体结构很相似,均方差仅为0.122A,但在pH6.5条件的晶体结构中,His B61具有双重构象,这种结构的变化可能与AHP IX-bp活性的pH依赖性相关.AHP IX-bp在两个不同pH条件下结构的差异揭示了IX/X因子结合蛋白与配体结合pH依赖性的结构基础.2、尖吻蝮蛇出血毒素IV降解产物acucetin的纯化、部分序列测定、性质鉴定和初步晶体学研究 AaH IV是Agkistrodon acutus蛇毒中一种P-Ⅲ型的金属蛋白酶,该蛋白在37℃、中性或弱碱性条件下,能很快地发生自降解反应,生成一个稳定的降解产物,命名为acucetin,其分子量约为30kDa.测定的Acucetin的部分序列显示acucetin没有金属蛋白酶结构域,与从蛇毒中分离得到的含有类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域的蛋白序列同源性很高,acucetin也含有类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域.研究发现将反应体系的pH降低到弱酸性范围.AaH IV的自降解速度显著减缓.在pH4.0条件下,能分离得到分子量约为43kDa降解中间产物.Acucetin能抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集.在硫酸铵体系中获得了Acucetin的晶体,空间群为R<,32>,晶胞参数为a=b=155.98A、c=76.07A,V<,m>为2.97A<'3>/Da,一个独立区仅有一个acucetin分子.获得Acucetin晶体的衍射数据为结构的解析奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一篇综述—蛇毒蛋白对凝血系统的作用

第一章凝血系统及止血过程

第一节凝血系统

第二节凝血过程

第二章蛇毒蛋白对凝血系统的作用

参考文献

第二篇蝮蛇毒IX因子结合蛋白(AHPIX-bp)的纯化、生化性质鉴定、cDNA序列测定、晶体生长和结构分析研究

第一章综述—蛇毒C-型凝集素类似蛋白研究进展

第一节C-型凝集素简介

第二节蛇毒C-型凝集素类似蛋白研究进展

第二章实验结果和讨论--江浙蝮蛇毒IX因子结合蛋白AHPIX-bp在pH 6.5和pH 7.5条件下的结构和功能关系研究

第一节AHP IX-bp的分离纯化和基本生化性质鉴定

第二节AHP IX-bp的生物学功能

第三节AHP IX-bp cDNA序列的测定

第四节AHP IX-bp的初步晶体学研究

第五节AHP IX-bp的模型质量分析

第六节AHP IX-bp的整体结构

第七节AHP IX-bp的二硫键构像

第八节AHP IX-bp的金属离子结合位点

第九节AHP IX-bp的结构域交换

第十节蛇毒C一型凝集素类似蛋白晶体结构比较

第十一节IX/X因子结合蛋白对结合配体的选择性

第十二节AHP IX-bp与Ⅸ因子pH依赖性结合可能的机理

小结

第二章实验材料和方法

第一节实验材料

第二节蝮蛇毒IX因子结合蛋白AHP IX-bp的分离纯化及生化性质研究

第三节AHP IX-bp的序列测定

第四节AHP IX-bp的晶体生长和X-射线衍射数据收集

第五节AHP IX-bp的分子置换研究

第六节AHP IX-bp的晶体结构修正

参考文献

第三篇尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ降解产物acucetin的纯化、部分序列测定、性质鉴定和初步晶体学研究

第一章综述—蛇毒锌金属蛋白酶及其降解产物的研究进展

第一节蛇毒锌金属蛋白酶的分类

第二节蛇毒金属蛋白酶的功能研究进展

第三节蛇毒金属蛋白酶的自降解及其降解产物功能研究进展

第四节蛇毒锌金属蛋白酶晶体结构研究进展

第二章实验结果和讨论—尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ降解产物acucetin的生化性质和初步晶体学研究

第一节AaHⅣ的自降解及降解产物acucetin、AaH Ⅳ→aecetin降解中间物的纯化及部分氨基酸序列的测定

第二节Acucetin的生化性质研究

第三节Acucefin的初步晶体学研究

小结

第三章实验材料和方法

第一节实验材料

第二节AaHⅣ的自降解及降解产物的纯化

第二节Acucetin的生化性质研究

第四节Acucefin的晶体生长和X-射线衍射数据收集

参考文献

附录已发表和投稿的学术论文