基于miR--34a调控SIRT1/NF--κB信号通路探讨清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的作用机制

摘要

糖尿病是临床最常见的内分泌代谢疾病之一，其中90％以上为2型糖尿病(Type2diabetes mellitus，T2DM)。2019年国际糖尿病联盟发布的最新调查数据显示，全球20-79岁的成人中约有4.63亿患有糖尿病，患病率为9.3％，预计到2030年将达到5.78亿(10.2％)。胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是T2DM发病的始动因素，并贯穿T2DM发展的全过程。积极改善IR成为治疗T2DM的关键策略。临床常用于改善IR的药物如双胍类、噻唑烷二酮类，往往存在一定的副作用，长期服用还可能出现失效现象。　　中医学在治疗T2DM方面具有鲜明的优势。中医理论认为，阴虚热盛是消渴病的基本病机。导师林兰教授在多年的临床实践中针对阴虚热盛型T2DM-IR确立了滋阴清热的基本治法，以其经验方—清润方（知母、黄柏、地骨皮等）为核心处方加减治疗，取得了良好疗效。课题组前期研究发现，清润方可减轻T2DM大鼠炎症反应和氧化应激，改善IR状态，但其深层次的分子机制尚待进一步探索。　　大量研究证实，T2DM在一定程度上是机体的低度炎症状态。炎症因子的释放可干扰胰岛素信号转导通路，导致IR的发生。SIRT1/NF-κB信号通路在介导肝脏炎症反应中发挥关键作用。微小核糖核酸(Micro ribonucleic acid，microRNA)是非编码RNA中一类重要的基因调节家族，可通过与靶基因3’端完全或不完全互补结合在转录或转录后水平影响靶基因的表达。研究显示，多种microRNA在T2DM-IR中呈现异常表达，其中miR-34a与肝脏糖脂代谢失调密切相关。而miR-34a可作为SIRT1的上游，直接靶向负性调控SIRT1的表达。　　因此，本研究在国家自然科学基金项目“基于miRNA调控SIRT1/NF-κB信号通路探讨滋阴清热法治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的分子机制”(No.81573792)的资助下，以前期工作为基础，集中探讨miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路在T2DM肝脏IR发病中的作用及清润方的干预机制，以期进一步发掘有效的治疗靶点，为中医药防治T2DM提供有力的理论和实验依据。　　研究目的：　　(1)通过体内实验和体外实验结合，研究清润方改善T2DM大鼠和IR-HepG2细胞IR的作用;　　(2)以miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路为切入点探讨清润方改善T2DM-IR的分子机制。　　研究方法：　　(1)体内实验　　以SD大鼠为研究对象，采用高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型，分为正常组、模型组、清润方高剂量组、清润方中剂量组、清润方低剂量组和二甲双胍组，每组10只，各组分别给予相应的药物灌胃干预8周。观察大鼠的一般状态，分别于药物干预前和干预后的第2、4、6、8周末记录大鼠体重并检测大鼠空腹血糖(FBG)，于药物干预后的第7周末进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，并计算血糖曲线下面积(GAUC)。干预结束后腹主动脉取血和肝组织，放射免疫法检测空腹血清胰岛素(FINS)水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，氧化酶法和直接法检测血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)水平，蒽酮法检测肝糖原含量，HE染色观察肝组织的病理改变，透射电镜观察肝脏超微结构。ELISA法检测肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的水平，Western blot法检测肝组织沉默信息调节因子1(SIRT1)、核转录因子κB(NF-κB)、胰岛素受体底物1(IRS1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的蛋白表达水平，RT-PCR法检测肝组织miR-34a、SIRT1mRNA、NF-κBmRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA的基因表达水平。　　(2)体外实验　　以人肝癌细胞株HepG2细胞为研究对象，以不同浓度的清润方干预HepG2细胞24h后，CCK8法检测清润方对HepG2细胞增值活性的影响，筛选清润方的干预浓度。采用1×10-6mol/L的胰岛素诱导36h建立IR-HepG2细胞模型，分为正常组、模型组、清润方组和二甲双胍组，各组分别给予相应的药物干预。葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量，葸酮法检测糖原含量，ELISA法检测TNF-α、IL-6的水平，Western blot法检测SIRT1、NF-κB、IRS1、GLUT4蛋白表达水平，RT-PCR法检测miR-34a、SIRT1mRNA、NF-κBmRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA的基因表达水平。采用脂质体转染法向HepG2细胞转染miR-34a inhibitor，Western blot法和RT-PCR法检测相应的蛋白及RNA的表达水平。　　研究结果：　　1.体内实验　　(1)与正常组比较，模型组大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、FINS、HOMA-IR、GAUC水平均明显升高(p＜0.05)，肝糖原含量明显降低(p＜0.05)。与模型组比较，清润方中剂量组大鼠第8周体重明显升高(p＜0.05):清润方高剂量组第8周FBG水平明显降低(p＜0.05);清润方低剂量组和清润方高剂量组FINS、HOMA-IR水平明显降低(p＜0.05);清润方各剂量组GAUC水平有所下降，但差异不明显(p＞0.05);清润方各剂量组TC、TG、LDL-C水平均明显降低(p＜0.05);清润方高剂量组肝糖原含量明显升高(p＜0.01);肝组织HE染色观察显示，模型组大鼠肝组织出现明显的脂肪变性和空泡变性，透射电镜观察其超微结构显示，模型组大鼠肝细胞出现线粒体、内质网等细胞器的损伤及散在脂滴，清润方各剂量组其病理变化较模型组均有不同程度的改善。　　(2)ELISA结果显示，与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6水平明显升高(p＜0.01)。与模型组比较，清润方高剂量组TNF-α水平明显降低(p＜0.05)，清润方中剂量组和清润方高剂量组IL-6水平明显降低(p＜0.05)。Western blot结果显示，与正常组比较，模型组SIRT1、GLUT4蛋白表达水平明显下调(p＜0.05)，IRS1蛋白表达水平下调，但差异不明显(p＞0.05)，NF-κB蛋白表达水平明显上调(p＜0.01);与模型组比较，清润方各剂量组NF-κB蛋白表达水平明显下调(p＜0.05)，清润方高剂量组GLUT4蛋白表达水平明显上调(p＜0.05)，清润方各剂量组SIRT1、IRS1蛋白表达水平有所上调，但差异不明显(p＞0.05)。RT-PCR结果显示，与正常组比较，模型组肝组织miR-34a、NF-κBmRNA表达水平明显上调(p＜0.01)，SIRT1mRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平明显下调(p＜0.05):与模型组比较，清润方高剂量组SIRT1mRNA、IRS1mRNA表达水平明显上调(p＜0.05)，NF-KBmRNA表达水平明显下调(p＜0.05)，清润方低剂量组和清润方高剂量组miR-34a表达水平下调，GLUT4mRNA表达水平上调，但差异不明显(p＞0.05)。　　2.体外实验　　(1)清润方干预HepG2细胞后对其增殖有一定的抑制作用，当清润方干预浓度为5mg/mL时，细胞增殖活性仍为（94.15士6.23）％，选择此浓度作为清润方的工作浓度。1×10-6mol/L的胰岛素诱导HepG2细胞36h后，HepG2细胞葡萄糖消耗量明显减少(p＜0.01)，糖原含量明显降低(p＜0.01)，提示IR-HepG2细胞模型诱导成功。清润方干预后能提高IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量，但与模型组比较差异不明显(p＞0.05)，并能显著提高IR-HepG2细胞糖原含量(p＜0.05)。　　(2)ELISA结果显示，与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6水平明显升高(p＜0.01);与模型组比较，清润方组TNF-α、IL-6水平明显降低(p＜0.01)。Western blot结果显示，与正常组比较，模型组SIRT1、IRS1、GLUT4蛋白表达水平明显下调(p＜0.01)，NF-κB蛋白表达水平明显上调(p＜0.01);与模型组比较，清润方组SIRT1、GLUT4蛋白表达水平明显上调(p＜0.05)，IRS1蛋白表达水平上调，NF-κB蛋白表达水平下调，但差异不明显(p＞0.05)。RT-PCR结果显示，与正常组比较，模型组miR-34a、NF-κBmRNA表达水平明显上调(p＜0.01)，SIRT1mRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平明显下调(p＜0.01);与模型组比较，清润方组NF-κBmRNA表达水平明显下调(p＜0.05)，miR-34a表达水平下调，但差异不明显(p＞0.05)，SIRT1mRNA表达水平明显上调(p＜0.01)，IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平上调，但差异不明显(p＞0.05)。miR-34a inhibitor转染HepG2细胞后，Western blot结果显示，与inhibitor-NC组比较，inhibitor组SIRT1、IRS1、GLUT4表达水平上调，NF-κB表达水平下调，但差异不明显(p＞0.05)。RT-PCR结果显示，与inhibitor-NC组比较，inhibitor组miR-34a表达水平明显下调(p＜0.01)，SIRT1mRNA表达水平明显上调(p＜0.05)，IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平上调，NF-κBmRNA表达水平上调，但差异不明显(p＞0.05)。　　研究结论：　　(1)清润方可减轻T2DM大鼠糖脂代谢紊乱，改善IR状态，缓解肝脏病理损伤;提高IR-HepG2细胞的葡萄糖摄取和糖原合成能力，改善IR状态。　　(2)清润方改善T2DM肝脏IR的作用可能是通过抑制miR-34a的表达，激活SIRT1/NF-κB信号通路，减轻肝脏炎症反应对胰岛素信号转导通路的损伤，提高胰岛素敏感性实现的。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章文献综述

综述一：microRNA在2型糖尿病胰岛素抵抗中的研究进展

1 microRNA概述

2 microRNA与胰岛素信号转导系统

3 microRNA与糖脂代谢紊乱

4 microRNA与炎症反应

5小结与展望

综述二：中医学对2型糖尿病胰岛素抵抗的认识及治疗概况

1中医学对2型糖尿病胰岛素抵抗的理论认识

2中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的研究概况

3小结与展望

参考文献

前言

第二章实验研究

实验一清润方对T2DM大鼠胰岛素抵抗作用的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二清润方改善T2DM大鼠肝脏胰岛素抵抗作用的机制研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验三清润方对IR-HepG2细胞胰岛素抵抗作用的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验四 清润方改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗作用的机制研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

结论

创新点与不足之处

参考文献

致谢

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