乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索

摘要

研究目的:　　1.采用脊神经结扎(Spinal Nerve Ligation，SNL)模型，模拟神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP)的疾病状态，考察乌头汤缓解NP的镇痛作用特点，并分析其作用于NP的病理环节。　　2.通过网络药理学方法预测乌头汤缓解NP的分子调控机制，并结合化学特性评价、分子对接模拟、表面等离子共振结果筛选乌头汤缓解NP的关键药效物质。　　3.采用两种NP动物模型，借助激动剂和拮抗剂从正、反两个方向，验证乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制。　　研究方法:　　1.乌头汤缓解NP的药效特点及其药理作用探索　　1.1动物及分组　　1.2镇痛药效学指标的检测　　1.2.1机械痛阈值　　1.2.2热痛阈值　　1.2.3炎症因子及趋化因子蛋白表达量的检测　　1.3转录组表达谱检测　　1.4差异表达基因的筛选与分析　　1.5“基因-基因”相互作用网络的构建与分析　　1.6通路富集分析　　2.乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选　　2.1乌头汤候选靶标谱的获取以及疾病相关基因的收集　　2.2“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络的构建与分析　　2.3通路富集分析　　2.4分子对接　　2.5表面等离子共振实验　　2.6药物的药代动力学特征检测　　3.乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制验证　　3.1动物及分组　　3.2镇痛药效学指标的检测　　3.2.1机械痛阈值　　3.2.2冷痛阈值　　3.3乌头汤镇痛关键药效物质的分子机制验证　　3.3.1乌头汤及其镇痛药效物质对趋化因子信号通路的调控作用　　3.3.2乌头汤及其镇痛药效物质对炎症因子的调控作用　　研究结果:　　1.乌头汤的镇痛作用特点　　1.1SNL模型的评价　　与Sham组相比，SNL模型导致动物短期（1-2天）及持续性的（21天）的机械痛阈值降低、对热刺激的延迟时间缩短（均P＜0.05）;脊髓背角组织中炎性因子和趋化因子的蛋白表达量增加（均F＜0.05）。　　1.2乌头汤可以有效缓解SNL小鼠的疼痛症状　　行为学结果表明，SNL小鼠在乌头汤给药后机械痛阈值和热痛阈值均显著升高（均P＜0.05）。　　ELISA结果表明，乌头汤在3.15～12.60g/kg范围内可有效降低SNL小鼠L5脊髓背角中IL-1β、TNF-α、CCL2、CXCL1的蛋白表达量。　　1.3NP相关基因主要参与胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症　　转录组检测结果表明，SNL组与Sham组具有显著性差异，共有567个差异表达基因（上调基因331个、下调基因236个），包含18个已知NP相关基因(ADCY1、ADRA2A、B4GALT3、BRAF、BTG2、CHRNA4、DYNC1H1、EGFR、GLO1、HTR1D、IL1R1、PDGFRA、PDPK1、PGR、PNPLA6、SCN1B、TEK和WARS)。　　“SNL所致NP失衡网络”包含765个节点和4774条边，其中248个hub节点为NP相关基因。通路富集分析结果表明，上述基因主要显著富集在胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症相关的信号通路（P＜0.05）。　　1.4乌头汤镇痛相关基因主要调控胶质细胞活化和神经炎症反应　　转录组检测结果显示，SNL-乌头汤组与SNL组，共有442个差异表达基因，其中171个为上调基因，271个为下调基因。此外，分层聚类分析结果表明，SNL-乌头汤组与SNL组具有显著性差异。　　根据上述差异表达基因构建的“乌头汤镇痛药效相关网络”，由375个节点和3077条边组成。其中，94个关键hub基因为乌头汤发挥镇痛效应的关键基因。通路富集分析显示，上述关键hub基因主要富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路（P＜0.05）。　　2.乌头汤镇痛关键药效物质及其网络调控机制的研究结果　　本课题组共鉴定出乌头汤及其所含五味中药水煎液中162种化学成分，用于药物的ADME特性评价。前期共得到乌头汤候选靶标1744个，其中107个是现存镇痛药物的作用靶标。通路富集分析显示，上述靶标主要参与神经炎症反应相关的信号通路，如趋化因子信号通路和TNF信号通路，等。　　基于“NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络，筛选出453个hub节点，构建其直接相互作用网络，将其中具有网络拓扑重要性的130个关键hub节点，视为乌头汤的候选镇痛靶标。通路富集分析显示，上述靶标在趋化因子信号通路的富集显著性最高（P=6.30E-31），参与该通路的方药靶标有CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA和AKT。　　将乌头汤中41种具有较好口服生物利用度和成药性的化学成分与其对应靶标进行分子对接，以分子对接的绝对值大于5.0作为卡值发现其中8种与其对应靶标具有请结合，其中芍药苷、甘草苷靶标中涉及多个趋化因子信号通路成员分子。进一步分别模拟芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路6个成员分子的结合情况，发现二者与上述6个靶标均呈现强结合。表面等离子共振实验检测结果表明，芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路最上游的CCL5蛋白之间的解离平衡常数(KD)分别为6.667μM、10.85μM，提示芍药苷、甘草苷均与CCL5蛋白具有微摩尔级别的强亲和力。　　血浆中药物的浓度可以在一定程度上反映药物在体内环境产生的药理效应，单次给药乌头汤（临床四倍等效量）或相当剂量的芍药苷-甘草苷组合后，发现与乌头汤相比，芍药苷-甘草苷组合给药后镇痛关键药效物质芍药苷、甘草苷的血药浓度峰值高、血药浓度达峰值时间短，提示组合药物在体内具有更大的暴露量。　　3.乌头汤镇痛关键药效物质组合的作用特点及其分子机制验证结果　　3.1乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的症状　　采用SNL模型和MIP诱导NP模型的行为学检测结果表明，芍药苷-甘草苷组合可有效升高大鼠的机械痛阈值和冷痛阈值（均P＜0.05），且药效与乌头汤全方相比，不存在显著性差异，但是优于单独给药芍药苷或甘草苷组（均P＜0.05）。　　3.2乌头汤及其关键镇痛药效物质均可抑制趋化因子信号通路　　免疫组化结果显示，与Sham组相比，SNL大鼠脊髓背角组织中CCL5的表达明显增强;乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显著降低SNL大鼠的CCL5的表达（均P＜0.05）;而单独给药芍药苷或甘草苷对CCL5的表达均无明显影响。此外，SNL大鼠L5左侧脊髓背角组织中CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA和AKT的基因表达量均显著升高（均P＜0.05），乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均显著下调其基因表达量（均P＜0.05），且芍药苷-甘草苷组合用药的效果优于单独使用芍药苷或甘草苷（均P＜0.05）。蛋白水平的检测结果与基因水平的检测结果一致。ELSIA结果表明，乌头汤及芍药苷-甘草苷组合可以减少SNL大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量（均P＜0.05）。上述研究结果表明，芍药苷-甘草苷组合可有效抑制趋化因子信号通路并减少炎症因子的表达量，表明芍药苷和甘草苷是乌头汤发挥镇痛效应的关键药效物质（均P＜0.05）。　　研究结论:　　本研究通过计算机预测与实验验证相结合的方法，预测乌头汤缓解NP的分子作用机制并筛选其关键镇痛药效物质，主要研究结论如下：　　1.采用SNL模型的药效学实验明确了乌头汤缓解NP的药效，具体表现在乌头汤可有效升高模型动物的机械痛阈值和热痛阈值，显著降低与胶质细胞活化相关的炎症因子和趋化因子的蛋白表达量;根据转录组表达谱的检测结果，分析NP的发病机制与乌头汤的镇痛机制，发现胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症是NP疾病进程中的三个关键病理环节，乌头汤的镇痛效应基因主要参与调控胶质细胞活化和神经炎症。　　2.预测乌头汤缓解NP的网络调控机制为抑制趋化因子信号通路(CCL5-CCR5-GNAI1-SRC-PIK3CA-AKT)介导的神经炎症，根据机制重要性，芍药苷和甘草苷被筛选为乌头汤缓解NP的关键镇痛药效物质。　　3.采用经典的SNL模型及鞘内注射MIP诱导的NP大鼠模型，验证了芍药苷-甘草苷组合缓解NP的药效（芍药苷、甘草苷的使用剂量为四倍临床等效剂量乌头汤中的含量），在该剂量条件下芍药苷-甘草苷组合的药效优于单独使用芍药苷或甘草苷。分子机制层面，芍药苷-甘草苷组合可以显著抑制趋化因子信号通路及炎症因子的表达。　　综上，本文综合利用转录组表达谱检测、药物靶标预测、网络构建与分析、分子对接、表面等离子共振检测、药代动力学特征分析、实验验证等方法，明确了经方乌头汤缓解NP的镇痛药效，揭示了乌头汤的镇痛关键药效物质芍药苷-甘草苷组合通过抑制趋化因子信号通路介导的神经炎症发挥缓解NP的分子机制。上述科学发现丰富了治痹经方乌头汤的镇痛科学内涵，同时，为研发药效成分清楚、作用机制明确、源于中药的镇痛组合药物提供实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词

文献研究

综述一中医药缓解神经病理性疼痛的研究进展

综述二网络药理学在组合药物研究中的应用

参考文献

引言

课题研究思路与技术路线图

第一部分乌头汤缓解NP的药效及其药理作用探索

1．材料

1．1数据库

1．2软件

1．3实验动物

1．4实验用药物及试剂

1．5仪器设备

2．方法

2．1分组与给药

2．2 SNL模型的构建

2．3乌头汤镇痛药效学指标的检测

2．4转录组表达谱样本的制备及检测方法

2．5差异表达基因的筛选

2．6“基因-基因相互作用网络”的构建与分析

2．7通路富集分析

3．1 SNL模型显著降低小鼠的机械痛阈值和热痛阈值

3．2乌头汤可显著改善NP小鼠的疼痛症状

3．3 NP发病相关的基因主要调控胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症

3．4乌头汤镇痛效应基因显著富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路

4．讨论

4．2乌头汤可有效缓解NP的症状

4．3乌头汤的镇痛作用与抑制胶质细胞活化和神经炎症有关

5．小结

第二部分乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选

1．材料

1．1数据库

1．2软件

1．3实验动物

1．4实验用药物及试剂

1．5仪器设备

2．方法

2．1乌头汤候选靶标谱的收集

2．5表面等离子共振技术检测化合物与蛋白的结合情况

2．6药代动力学检测

2．7统计分析

3．结果

3．1乌头汤的镇痛候选靶标显著富集于趋化因子信号通路

3．2乌头汤的镇痛关键药效物质筛选

4．讨论

4．1趋化因子信号轴可介导神经炎症

4．2芍药苷和甘草苷具有镇痛作用

5．小结

第三部分乌头汤镇痛关键药效物质的作用特点及其分子机制的验证研究

1．材料

1．1实验动物

1．2实验用药物及试剂

1．3仪器设备

2．1动物与分组

2．2 NP模型构建

2．3疼痛评价方法

2．4取材及组织处理方法

2．5动物组织冰冻切片

2．6免疫组化染色法检测GFAP、NeuN及CCL5的表达

2．7 Rea卜time PcR方法检测趋化因子信号通路成员分子的基因表达水平

2．8 Western blot方法检测趋化因子信号通路成员分子的蛋白表达水平

2．9 ELISA方法检测炎症因子的含量

2．10统计学分析

3．结果

3．1乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的疼痛症状

3．2乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效降低SNL大鼠L5脊髓背角组织中GFAP以及CCL5的表达

3．3乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显著抑制趋化因子信号通路的表达

4．讨论

4．1 CCL5和CCR5与NP的发生和维持密切相关

4．2芍药苷-甘草苷组合有望成为新的镇痛组合药物

5．小结

全文总结与展望

一、论文的主要研究成果

二、论文的特色与创新点

三、本课题的不足之处

四、本课题的拓展研究计划

参考文献

致谢

个人简历