基于网络药理学优化的三阴方干预EMT抑制三阴乳腺癌转移机制研究

摘要

三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)在所有乳腺癌的分型中约占15-20％，其雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体一2(human epidermal growth factor-2，HER2)的表达均为阴性。三阴乳腺癌具有治疗后区域复发率高、远处转移率高、预后差的特点，治疗后发生远处转移是患者死亡的首要原因，初诊为TNBC的患者一般在三年内会出现复发转移，发生远处转移的三阴乳腺癌患者的5年相对生存率为11.5％，手术和化疗仍是三阴乳腺癌的主要治疗方法，目前尚无特定靶向治疗的药物，因此发挥中医药的治疗作用，探寻其内在作用机理，具有重要意义。　　乳腺癌在中医属于“乳岩”等范畴，一般认为肿瘤转移复发与“虚”“毒”“瘀”密切相关。正气不足是肿瘤复发的根本病机，“瘀”、“毒”等余邪伏于体内，伺机而发是肿瘤复发的直接因素。现代医学的治疗手段如手术、放化疗等易伤正气，在正虚的前提下若有癌毒残存则正虚不能制邪，邪毒更易流窜它处，导致肿瘤的复发和转移。正气虚损为肿瘤的复发转移提供了前提条件，在此基础之上，气滞，血瘀，痰湿，热毒等互相博结，则发为癌毒，在癌毒成瘤后，进一步加剧气滞血瘀和热毒程度，阻滞气血经络运行，使肿瘤复发转移。　　调整机体阴阳、气血、脏腑功能平衡，对肿瘤患者进行中医药干预治疗，可延长患者的无复发生存期，甚至达“既病防变”的效果。卢雯平教授根据多年治疗三阴乳腺癌的临床经验总结出三阴方，全方以黄芪，天南星，皂角刺，海藻，白花蛇舌草，山慈菇作为治疗三阴乳腺癌的基本组方，在此基础上，通常结合患者的舌、脉、不适症状和体质辨证等加减用药。在2007年1月-2012年5月开展的队列研究中，我们将入组的101例三阴乳腺癌患者随机分为辨证服用中药联合西医治疗队列及单纯西医治疗队列，观察患者的3年无进展生存期及患者生存质量，结果显示，中西医结合组的3年无进展生存期较单纯西药治疗组延长，中药可改善因化疗引起的麻木等不适症状，提高患者生活质量。乳腺癌是广安门医院的优势病种，我们还参与了北京市科委课题《中医药对三阴性乳腺癌患者术后复发转移的干预研究》，据2019年5月的随访结果回报，2016年1月～2017年6月入组的60例中晚期三阴乳腺癌患者，中药治疗的3年内无复发生存率为88.3％，文献研究显示三阴乳腺癌的3年无复发生存率为66％，三阴方的疗效确切，其核心药味及内在机制值得深入研究。　　网络药理学是中药复方药效机制研究的高效方法，可以通过构建可视化网络，从多个层面提供药物活性成分，作用靶点，相关信号通路等方面的信息，预测中药复方的核心成分及作用机制。故本研究分为两个部分，第一部分通过网络药理学的方法探索三阴方的核心药味，预测三阴方的可能作用机制;第二部分根据第一部分的数据分析结果，开展实验研究，验证三阴方干预乳腺癌转移的内在机制，一方面为三阴方的临床应用及进一步推广提供理论基础，另一方面精简中药复方，进一步研究和验证“专病有专方”的中医理念，以期实现更高的卫生经济学效益。　　目的:　　通过网络药理学的方法，优化三阴方的组方配伍，探索其核心作用成分及内在的作用机制，并结合体外实验，观察三阴方对乳腺癌细胞的增殖，转移，侵袭等生物学特性的影响，依据网络药理学预测机制探索优化三阴方干预乳腺癌转移的作用机理。　　方法:　　第一部分:　　(1)检索网络数据库，查找三阴方的有效成分和作用靶点并归类总结。通过检索“GeneCard”数据库，获得三阴乳腺癌疾病相关的靶基因。将三阴乳腺癌的靶基因和中药有效成分的作用靶蛋白进行分子对接，使用Cytoscape软件建立“药物一成分一疾病.靶点”网络。　　(2)分析三阴方的“药物-成分-疾病-靶点”网络数据，总结三阴方的核心药味、有效成分，优化三阴方的配伍。通过建立三阴方的PPI网络，进行GO生物功能富集分析和KEGG{N号通路富集分析，筛选三阴方可能作用靶点、影响的生物功能及可能涉及的相关信号通路。　　第二部分:　　(1)以优化的三阴方作为研究对象，制备含药血清，设置空白血清组作为阴性对照组，分别加入高、中、低浓度的含药血清培养三阴乳腺癌细胞24h，48h，72h后，使用CCK8实验的方法，观察干预药物对乳腺癌细胞增殖能力的影响，找出最佳给药浓度及最佳干预时间。　　(2)选取三阴乳腺癌细胞，通过流式细胞仪检测干预药物对三阴乳腺癌细胞凋亡的影响。　　(3)加入不同浓度的干预药物，培养三阴乳腺癌细胞，通过Transwell迁移实验观察干预药物对三阴乳腺癌细胞迁移能力的影响。　　(4)培养三阴乳腺癌细胞，加入不同浓度的干预药物，通过Transwell侵袭实验观察干预药物对三阴乳腺癌细胞侵袭能力的影响。　　(5)通过RT.PCR实验方法，检测依据网络药理学的研究分析的结果，探索三阴方的核心作用机制。　　结果:　　第一部分:网络药理学　　(1)检索得到41三阴方有效活性成分，获得三阴乳腺癌疾病相关的靶基因3885个，在此基础上，删除重复和无关联项，构建三阴方的“药物-疾病-靶点”网络。　　(2)通过数据分析可知，三阴方中黄芪、皂角刺、白花蛇舌草的作用网络较为广泛，是三阴方中的核心药味;槲皮素、山奈酚、豆甾醇、D-谷固醇等为三阴方中的主要活性成分:AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、EGF等位于PPI网络核心位置;从GO生物过程富集结果分析看，三阴方作用的靶蛋白涉及的生物过程主要影响细胞信号转导和增殖、凋亡等;从KEGG信号通路富集分析看，P13K/AKT信号通路为主要涉及的通路。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是肿瘤转移的中轴环节，肿瘤细胞通过EMT获得的侵袭力，此时，E-cadherin下调，Vimentin、N-cadhefin上调，细胞间的粘附作用减弱，上皮细胞失去细胞极性及与基底膜的连接，多项研究证明P13K/AKT信号通路与EMT转化过程密切相关，因此推测三阴方可能通过P13K/AKT信号通路干预肿瘤细胞的EMT的发生，抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。　　第二部分:实验研究　　(1)以CCK8实验的方法观察干预药物对乳腺癌细胞增殖的影响，加入不同浓度含药血清处理后，结果发现24h、48h高浓度组，48h中浓度组细胞的OD值低于空白血清对照组，结果具有统计意义(P＜0.05)，说明高浓度组干预24h、48h，中浓度组干预48h，细胞增殖能力受到抑制，其中高浓度组含药血清作用24h的抑制效果最明显，抑制率约为38.7％。　　(2)AV-PI实验中，以高浓度干预药物作用细胞24h后细胞的凋亡比例约为18.33％，与Control组对比，干预组的凋亡比例增加，结果具有统计学意义(P＜0.05)，说明高浓度含药血清可以促进4T1细胞的凋亡。　　(3)以Transwelld、室实验检测细胞细胞的迁移能力，结果显示:高、中浓度组含药血清均可抑制细胞迁移，高浓度组效果优于中浓度组，低浓度含药血清对细胞迁移能力无明显抑制作用。　　(4)以Transwelldx室实验检测细胞细胞的侵袭情况，结果显示:高、中浓度组含药血清均可抑制细胞侵袭，但是高浓度与中浓度含药血清对细胞的侵袭作用无明显差别，低浓度组无明显抑制细胞侵袭能力的作用.　　(5)通过RT-PCR实验发现，以三阴方核心药物含药血清干预后，细胞的E.cadherin的相对表达量上升(P＜0.05)，Vimentin相对表达量下降(P＜0.05)，N.cadherin表达无明显变化(P＞0.05)，但是呈下降趋势，细胞EMT的过程受到抑制。　　结论:　　(1)根据网络药理学数据分析结果，优化三阴方的核心处方为:黄芪、皂角刺、白花蛇舌草;三阴方主要活性成分为槲皮素、山奈酚等，主要作用靶点为AKTl、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、EGF，涉及的生物过程与信号通路转导、细胞增殖、凋亡相关，主要作用于P13K/AKT信号通路，可能作用机制为通过P13K/AKT信号通路，干预肿瘤细胞的EMT，从而抑制细胞迁移与侵袭。　　(2)实验部分基本吻合网络药理学的预测机制，优化三阴方含药血清能够有效抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭能力，抑制三阴乳腺癌细胞发生EMT。

目录

声明

摘要

英文略缩词

综述

前言

一、网络药理学分析三阴方

1．研究方法

1．1筛选三阴方有效成分及靶基因

1．2获取三阴乳腺癌相关基因

1．5基因本体(GO)功能富集分析和与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

2．结果

2．1三阴方主要活性成分

2．2三阴方靶蛋白及TNBC相关基因

2．3三阴方的“药物-成分-靶点-疾病”网络

2．4单味中药的拓扑学网络

2．5蛋白相互作用(PPI)网J络核心基因

2．6基因本体(GO)功能富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

3．讨论

4．小结

二、优化三阴方干预乳腺癌转移的实验研究

1．实验材料

1．1细胞系

1．2实验试剂和器材

1．3主要仪器

1．4主要溶液配置

2．实验方法

2．1细胞培养

2．2含药血清制备

2．3加药方法

2．4CCK8法检测细胞增殖

2．5流式细胞术检测细胞凋亡

2．6Transwell体系检测细胞迁移

2．7Transwell体系检测细胞侵袭

2．8实时定量荧光PCR

2．9统计学方法

3．结果

3．1三阴方可以抑制乳腺癌细胞的增殖

3．2三阴方可以促进细胞的凋亡

3．3三阴方可以抑制细胞的迁移

3．4三阴方可以抑制细胞的侵袭

3．5三阴方影响EMT相关基因的表达

4．讨论

5．小结

结论

参考文献

致谢

个人简历