核桃芽接成活的组织学和转录调控机制研究

摘要

核桃(Juglans regia L.)是重要的经济林树种。我国核桃产业面临着规模化和商品化进程缓慢的突出问题，而良种无性繁殖特别是高效的芽接技术是解决这一问题的有效途径，所以核桃良种嫁接繁殖对实现我国核桃产业提质增效具有深远意义。在核桃芽接实践中，人们以生理学为指导尝试改变果树传统芽接时期和方式，进而使该技术获得重要进展。然而目前仍有经济林树种存在芽接成活的难的问题，因此有必要以核桃为试材，从机制上深入解析，为经济林乃至园艺作物的芽接快繁技术的改进和完善提供理论指导。本研究以核桃品种‘清香’为砧木，‘香玲’为接穗开展芽接试验，在分析影响芽接成活关键外部因素的基础上，针对芽接愈合关键时期，建立组织和细胞特征图谱，进而开展基因组转录机制解析，在分子水平揭示关键调控基因，从核心生理过程深入认识核桃芽接成活机制，主要结果如下:　　(1)砧穗的的发育状态、芽接时期和保证接穗“护芽肉”的完整是影响核桃芽接成活的主要因素。采用核桃本砧方块芽接法进行试验，发现中部接芽和处于半木质化状态的砧木组合成活率最高，达93.6％;芽接成活率在萌芽后45天和105天嫁接中达到峰值，分别为94.5％和66.7％，二者差异极显著(P＜0.01);接后第0天和第3天灌水均会严重抑制芽接成活，而第6天和9天之后灌水，对芽接成活率影响小。通过对“护芽肉”外部形态、组织切片和电镜扫描进行观察，发现“护芽肉”属于叶芽茎尖成熟区组织，取接穗芽片时，需将“护芽肉”保存完好，否则会导致接芽不能萌发，嫁接不成活;　　(2)克服各部分组织软硬不均、易脱落等难题，建立了适用于核桃等非均质化组织的石蜡切片方法。具体试验流程如下:采用改进后的固定液(70％叔丁醇:35％-40％甲醛:丙酸:丙王醇=85:5:5:5，v/v/v/v)对核桃芽接茎段材料进行同定;软化处理:过氧化氧-冰醋酸混合溶液(1:1.v/v)，处理3小时后，转入70％叔丁醇-丙三醇混合溶液(1:1，v/v)中，于50℃恒温箱中处理2天;采用叔丁醇梯度脱水法，由于叔丁醇有脱水和透明的双重作用，可以省去透明步骤;浸蜡:用叔丁醇替换二甲苯将材料过渡罕纯石蜡中。　　(3)砧穗形成层间的愈合方式是芽接成活的最佳方式，并发现由木射线细胞主导的砧穗愈合新方式。在萌芽后40-47天、70-77天和100-107大的芽接成活关键州时期开展芽接试验，并对其愈合过程进行组织学观察，发现砧穗愈合有3种方式，分别为:方式1砧穗形成层间的愈合，约12-15天完成;方式2砧木木质部和接穗形成层间的愈合，约15-18天完成;方式3砧穗木质部间的愈合，约25-30天完成。其中方式3是新发现的核桃芽接愈合方式，其特点是:愈伤组织由木射线细胞脱分化产生;砧木隔离层要先于接穗发生消解;完成愈合的时间长，芽接成活率低。通过组织学观察发现阻碍芽接成活的主要原因是接后愈伤组织的增殖和分化受到抑制，或砧穗隔离层无法正常或快速的消解。　　(4)基于组织学研究确定的芽接愈合关键时期进行精准采样，并开展对应的转录调控分析。筛选出2011个显著差异表达基因，功能富集结果显示:这些差异基因主要参与植物激素信号转导、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、MAPK信号通路等代谢途径;采用加权共表达网络分析方法，鉴定出芽接愈合过程中参与植物激素内稳态和信号转导通路的基因NCED1、AFP2、PIR18H和PYL8;参与植物细胞壁合成途径的基因TBL38;重要转录因子基因MYB44;参与植物创伤信号响应的UPF3等发挥枢纽调控作用的功能基因。　　(5)在差异基因加权共表达网络所得结果的基础上，研究了核桃芽接愈合过程中内源激素IAA、ABA和ZR的时空分布，以及相关酶活性的动态变化。发现IAA和ZR的动态变化趋势一致，在愈伤组织快速增殖期含量上升，聚集在接口形成层和砧木表面细胞中;愈伤组织进入分化状态后其含量迅速下降，主要分布于愈伤组织;ABA在愈伤组织快速增殖期的含量和分布位置均无明显变化，愈伤组织进入分化状态后，其含量急剧上升，且集中分布于接穗形成层和愈伤组织，从而提出了芽接愈合过程中内源激素的时空分布模型。IAA/ABA、IAA/ZR和ZR/ABA比值动态变化趋势分别呈现“S”型、“M”型和“N”型。PP0活性在愈伤组织形成期问期迅速上升;PAL活性一直呈上升趋势;抗氧化酶类(SOD、POD和CAT)的动态变化均呈现先上升后下降的趋势。