亚洲棉纤维发育关键基因GaHD1上游调控因子解析

摘要

GaHD1基因为HD-ZIP IV转录因子家族成员，主要起信号转导作用，其最终的信号受体为纤维发育相关功能基因。已有的相关报道发现GaHD1是控制茸毛和纤维起始的关键调控基因，并受赤霉素（GA3）诱导（本项目研究基础）。为了探索GaHD1的上游调控基因，同时验证GaHD1是否为正反馈调节基因，我们运用生物信息学方法，提取GaHD1上游启动子调控区域，分析其中是否含有HD1基因结合的顺式作用元件L1box，并预测和验证了直接调控GaHD1的上游基因。主要结果如下：　　1.首先克隆得到了GaHD1基因启动子，生物信息学分析启动子区潜在的顺式作用元件，根据L1box存在的位置，克隆了不同长度的4条启动子片段（HD1-Pro-R1、HD1-Pro-R2、HD1-Pro-Intron、HD1-Pro-full Length），分别构建了这4种启动子片段与GUS报告基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。GUS活性分析表明，4个启动子片段驱动GUS的表达情况有差异，其中，HD1-Pro-R1染色很淡，茎秆、叶片茸毛均无染色。HD1-Pro-R2颜色较深，叶片、茎秆茸毛均被染色，这可能是由于R2片段相较R1多了L1box，说明L1box是在茸毛中表达的非常重要的元件。HD1-Pro-Intron片段包括5’-UTR区域且只在叶片边缘有GUS染色，说明5’-UTR区有在叶片边缘特异性表达元件。HD1-Pro-full Length GUS活性极高，在几乎所有区域均表达。说明UTR部分的内含子元件可以使该启动子不仅可在叶片边缘特异性表达，还具有启动子增强作用。随后我们对转基因拟南芥叶片进行GUS活力检测，结果显示：HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS活力水平较低，而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length GUS活力水平很高，与染色结果一致，且达到显著水平。另外，我们将转HD1-Pro-full Length启动子的转基因拟南芥植株做石蜡切片，发现GUS活性在其茎和叶片表皮细胞中高亮表达。同时，我们用5μM GA3处理转基因拟南芥植株，结果显示，GA3处理后，HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS染色及其活力水平相较于处理前均几乎无变化，而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length因为含L1box，GUS活性均有所增加。这说明GA3能够诱导某些基因或转录因子起到结合L1box调控HD1基因表达的作用。　　2.体外验证GaHD1的上游调控转录因子，克隆了已知的与棉纤维发育相关的转录调节因子（GaHD1，GaHOX3，GaPDF2，GaMML9），分别将其与PCY载体融合，转化拟南芥原生质体，其中GaPDF2和GaMML9先前未研究过，我们对其进行了亚细胞定位的研究，结果发现这两个转录调节因子都在细胞核中表达。　　3.为了明确GaHD1，GaHOX3，GaPDF2，GaMML9这四个转录调节因子与GaHD1启动子的关系，本研究采用酵母单杂交方法。结果发现，GaHD1启动子能够与GaHD1，GaPDF2，GaMML9调节因子结合，不能与GaMML7，GaHOX3结合，说明GaHD1可以与自身基因结合；GaPDF2，GaMML9是HD1上游转录调节因子。　　4.利用烟草瞬时转化实验体内验证GaHD1的上游调控转录因子，结果发现，启动子HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron，分别共转化GaHD1，GaHOX3，GaPDF2，GaMML9调节因子后GUS活力水平和单一启动子相比无明显变化；启动子HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length含有L1box，分别共转化GaHOX3后GUS活力无显著变化，而分别共转化GaHD1，GaPDF2或GaMML9后烟草的GUS活力水平比单一启动子明显增强，说明GaHD1，GaPDF2，GaMML9能够结合到GaHD1启动子上并增强GaHD1基因表达，该试验进一步确认了HD1上游的调控因子。

目录

声明

一 前言

1.1 棉花概述

1.2 棉花纤维生长发育的分子调控机理

1.3 HD-ZIP转录因子

1.4 启动子

1.5SMA-4 突变体

2.1 试验材料

2.2 GaHD1基因启动子的克隆

2.3 GaHD1基因启动子的Motif分析

2.4 GaHD1启动子分段克隆

2.5 分段克隆启动子与GUS融合载体的重组及鉴定

2.6 拟南芥的遗传转化及筛选

2.7 转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测

2.8 HD1-Pro-full Length转基因拟南芥石蜡切片

2.9 5μM GA3处理转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测

2.10 结果与分析

2.11 小结与讨论

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 GaHD1启动子的酵母单杂交

3.4 结果与分析

3.5 小结与讨论

4.1 试验材料

4.2 烟草瞬时转化

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

五 总结与展望

5.1 总结

5.2 研究的创新点

5.3 展望

参考文献

附录一

附录二

个人简介

致谢