转录因子E2F1通过SRC3调节树突状细胞成熟机制的研究

摘要

作为免疫系统中最重要的抗原递呈细胞，树突状细胞起到起始适应性免疫应答并连接固有免疫应及适应性免疫应答的作用。树突状细胞的成熟和活化，需要多个信号通路和转录因子的协调，目前发现和报道的大部分研究集中于树突状细胞成熟和分化的正向调控。我们实验室前期研究观察到E2F1负调控树突状细胞成熟，提示了一个树突状细胞可能的反馈调节通路。为此，该研究拟深入探讨和揭示E2F1反馈调节树突状细胞成熟和分化的可能分子机制。
　　 SRC3是细胞代谢中重要的共激活因子，以往曾有报导SRC3是E2F1的调控基因。另外报导还发现，SRC3敲除小鼠中淋巴瘤发病率提高，提示其可能参与免疫细胞的成熟以及分化。
　　 本研究中，在对敲低E2F1的DC2.4细胞中检测发现，SRC3的表达水平下调;而在E2F1过表达细胞中，SRC3的表达水平也随着E2F1的高表达上调。上述实验结果提示SRC3可能是E2F1的靶基因。深入研究进一步发现，改变SRC3表达时，引起了包括AKT及p38等多条与树突状细胞成熟相关的信号通路的变化，同时部分树突状细胞表面受体也发生了显著的变化。实验结果提示E2F1可能通过转录调节SRC3，负调控树突状细胞成熟。为进一步揭示转录因子E2F1对SRC3的转录调控机制，对SRC3启动子序列进行分析，发现其中含有多个E2F1和Sp1潜在靶位点。在DC2.4细胞中敲低Sp1，检测证实Sp1可负调控SRC3。目前已构建了含有SRC3启动子序列上游-600-+58片度的报告基因质粒以及一系列截短质粒，细致地研究E2F1在转录水平上调控SRC3的分子机制正在进行。
　　 本文证实了在DC2.4细胞中，E2F1可能通过转录调控SRC3表达。发现在树突状细胞成熟过程中SRC3瞬时下调以及SRC3表达水平的改变调控了多条信号通路，提示SRC3可能在树突状细胞成熟过程中可能扮演着一定角色。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 树突状细胞

1．1．1 树突状细胞概述

1．1．2 树突状细胞的分化调控

1．1．3 树突状细胞重要的生物学意义

1．1．4 树突状细胞的生物学应用前景

1．2 SRCs家族蛋白成员的生物学功能

1．2．1 SRCs家族概述

1．2．2 SRCs家族生物学功能

1．2．3 类固醇受体共刺激因子SRC3的研究概况

1．2．4 SRC3(Steroid receptor coactivator-3)的生物学功能

1．3 转录因子E2F1概述

1．3．1 E2F蛋白家族

1．3．2 E2F调控代谢途径

1．3．3 转录因子E2F1

1．3．4 转录因子E2F1生物学功能

1．4 转录因子Sp1

1．4．1 转录因子Sp1概述

1．4．2 转录因子Sp1调控基因表达的概述

1．5 课题的研究意义和研究路线

1．5．1 课题的研究意义

1．5．2 课题的研究路线

第二章 实验材料与实验方法

2．1 质粒构建

2．1．1 试剂配制以及试剂

2．1．2 构建sh-BCAP质粒

2．1．3 构建pcDNA-BCAP质粒

2．1．3 构建报告基因相关质粒

2．2 细胞培养和转染

2．2．1 细胞系

2．2．2 细胞培养基

2．2．3 细胞培养相关材料

2．2．4 细胞培养仪器

2．2．5 细胞复苏、细胞传代以及细胞冻存

2．2．6 细胞转染(转染质粒)

2．2．7 细胞转染(转染siRNA)

2．2．8 细胞筛选

2．3 免疫印迹

2．3．1、试剂以及溶液配方以及仪器

2．3．2 实验步骤

2．4 mRNA抽提，RNA的反转以及real-Time PCR

2．4．1 mRNA的抽提

2．4．2 mRNA的反转

2．4．3 Real-Time PCR

2．5 流式检测细胞表面分子

第三章 实验结果

3．1 研究目的

3．2 E2F1正调控SRC3的表达

3．3 SRC3在树突状细胞成熟过程中瞬时下调

3．4 SRC3对Akt、p38和Erk信号通路的影响

3．5 SRC3对树突状细胞表面分子表达的影响

3．6 E2F1正调控SRC3的分子机制

3．7 SRC3调控接头蛋白BCAP，Gab2

第四章 讨论

4．1 E2F1正调控SRC3的表达

4．2 SRC3表达水平的变化影响多条信号通路

4．3 SRC3表达水平的变化影响多个接头蛋白

4．4 创新点

4．4．1 SRC3表达水平的变化影响树突状细胞的多条信号通路

4．4．2 在树突状细胞中发现转录因子E2F1调控SRC3

4．5 不足以及期望

参考文献

致谢