日本黄姑鱼肉活性肽的制备及其免疫调节作用研究

摘要

日本黄姑鱼(Nibea japonica)，俗称黑毛鲿，属于黄姑鱼属，主要分布在中国东海和日本南部海。日本黄姑鱼味道鲜美，营养丰富，但作为蛋白来源用于提取制备免疫活性肽的研究鲜为报道。本文以日本黄姑鱼鱼肉为原料，用酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽，经过超滤比较各截留组分的免疫活性，将免疫活性最高的＜1kDa的组分命名为日本黄姑鱼肉活性肽(Nibea japonica peptides，NJP)。研究NJP在体内体外水平的免疫调节作用，最后将NJP经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，Sephadex G25凝胶柱和RP-HPLC进行进一步的分离纯化。结果表明:　　(1)酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽的最佳用酶为木瓜蛋白酶。通过单因素及响应面优化，最优提取工艺参数为:料液比1∶11g/mL、pH6、温度59℃、时间5.4h。在此条件下，酶解肽对巨噬细胞RAW264.7的相对增殖率为62.3％。　　(2)探讨NJP对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。NJP对细胞无明显毒性，并且可显著提高巨噬细胞的增殖能力、吞噬功能、NO分泌量以及细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的分泌水平。流式细胞术分析结果表明，NJP对细胞的增殖有良好的促进作用，且主要作用在G0/G1期。　　(3)进一步探讨NJP的体内免疫调节作用，同时研究NJP对环磷酰胺免疫低下小鼠的抗氧化指标的影响。结果表明，NJP可提高小鼠免疫器官指数，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，提高小鼠脾淋巴细胞增殖，增强迟发型变态反应的程度，提高小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量及免疫球蛋白IgA、IgM、IgG的水平，并且对小鼠免疫器官的抗氧化活性具有一定的提升作用。　　(4)为了进一步探讨NJP的免疫活性的有效成分，通过超滤，DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，Sephadex G25凝胶柱和RP-HPLC对NJP成分进行纯化，获得了三个免疫活性肽，利用目标肽的N端测序，测得三条肽链Asp-Val-Ala-Asn，Tyr-Thr-Asn，Leu-Tyr-Gly-Asn。　　本课题从体内体外两个方面探索了日本黄姑鱼肉活性肽的免疫调节作用，以期为日本黄姑鱼肉的高值化利用及免疫活性肽保健食品的开发提供理论依据和技术支持。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一章前言

1．1海洋生物活性肽的概述

1．2海洋生物活性肽的功能

1．2．1免疫调节作用

1．2．2抗氧化作用

1．2．3降血压作用

1．2．4抗癌作用

1．3免疫活性肽

1．3．1免疫活性肽的制备

1．3．2免疫活性肽分离纯化

1．4本课题研究的意义及内容

1．4．1本课题研究的意义

1．4．2本课题研究的主要内容

第二章日本黄姑鱼肉活性肽酶解工艺研究

2．1材料与仪器

2．1．1材料与试剂

2．1．2仪器与设备

2．2实验方法

2．2．1细胞培养

2．2．3日本黄姑鱼肉粗肽提取工艺流程

2．2．4日本黄姑鱼肉粗肽的酶解制备

2．3结果与分析

2．3．1蛋白酶的筛选

2．3．2单因素试验

2．3．3响应面试验

2．3．4验证实验

2．4讨论

第三章日本黄姑鱼肉活性肽对巨噬细胞RAW 264．7的免疫调节作用的研究

3．1材料与仪器

3．1．1材料与试剂

3．1．2仪器与设备

3．2实验方法

3．2．1细胞培养

3．2．2日本黄姑鱼肉粗肽的制备

3．2．3日本黄姑鱼肉粗肽的分子量分布测定

3．2．4 NJP的制备

3．2．5 NJP对巨噬细胞RAW264．7的免疫作用

3．2．6数据处理

3．3结果与分析

3．3．1日本黄姑鱼肉粗肽分子量分布的测定

3．3．2 NJP的制备

3．3．3 NJP对细胞受损的影响

3．3．4 NJP检测细胞增殖实验

3．3．5 NJP对细胞形态变化的影响

3．3．6中性红测定NJP对巨噬细胞RAW 264．7吞噬的影响

3．3．7 NJP对巨噬细胞RAW 264．7分泌NO的影响

3．3．8 NJP对巨噬细胞RAW 264．7分泌细胞因子的影响

3．3．9 NJP对巨噬细胞RAW 264．7周期的影响

3．4结论与讨论

第四章日本黄姑鱼肉活性肽对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

4．1材料与仪器

4．1．1材料与试剂

4．1．2仪器与设备

4．1．3实验动物

4．2方法

4．2．1模型的建立与分组

4．2．2 NJP对小鼠体重的影响

4．2．3 NJP对小鼠胸腺和脾脏指数的影响

4．2．4 NJP对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

4．2．5 NJP对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响

4．2．6迟发型变态反应

4．3．1 NJP对小鼠体重的影响

4．3．2 NJP对小鼠胸腺和脾脏指数的影响

4．3．3 NJP对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

4．3．4 NJP对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响

4．3．5 NJP对小鼠迟发型变态反应的影响

4．3．6 NJP对小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的检测

4．3．7 NJP对小鼠血清免疫球蛋白检测

4．3．8小鼠体内抗氧化活性的检测

4．4结论与讨论

第五章日本黄姑鱼肉活性肽分离纯化

5．1材料与仪器

5．1．1材料与试剂

5．1．2仪器与设备

5．2实验方法

5．2．1日本黄姑鱼肉粗肽的提取

5．2．2 NJP的制备

5．2．3巨噬细胞RAW 264．7增殖实验

5．2．4 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析分离

5．2．6高效液相分离纯化

5．2．7目标肽的N端测序

5．2．8实验数据处理

5．3结果与分析

5．3．1 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析分离结果

5．3．2 Sephadex G-25凝胶柱层析分离结果

5．3．3高效液相分离纯化结果

5．4结果与讨论

第六章结论与展望

6．1结论

6．2研究的创新点

6．3进一步研究

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果