肺炎链球菌肽聚糖水解酶LytB与耐药相关蛋白Sp0010的结构与功能研究

摘要

Ⅰ.肺炎链球菌肽聚糖水解酶LytB的结构和功能研究
　　肺炎链球菌是人类的主要致病菌之一，它能导致重大人类疾病并造成每年一百六十多万人的死亡。研究证据显示肺炎球菌的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶LytB对肺炎链球菌的细胞分裂以及细菌在鼻咽部定植发挥重要作用，然而LytB的生化分子机制到目前为止还不清楚。我们解析了LytB催化结构域（残基从375位赖氨酸至658位天冬氨酸）的晶体结构(以下简称为LytBCAT)，其衍射分辨率为1.65(A)。LytBCAT由三个结构相对独立的模块SH3b、WW和GH73组成，这三个模块组成一个“T”字型沟槽构成了其催化活性中心。蛋白质三维结构比较结合计算模拟显示LytB的底物为四糖五肽，其催化关键残基为Glu564。体外酶活水解实验表明蛋白LytB更易于水解敲除基因lytB肺炎链球菌中的肽聚糖，这暗示了LytB的特异性底物为未成熟肽聚糖。结合体外长链分散实验和体内细胞分裂分析，我们证明了SH3b、WW和GH73三个模块对于蛋白LytB活性都是必需的。进一步的功能分析显示LytB的完整活性对于肺炎链球菌粘附和侵染人的肺上皮细胞是非常关键的。基于结构的序列比对，我们发现LytB这种特殊的结构模块组成方式在链球菌Streptococcus mitis和Gemella的同源蛋白中高度保守。我们的研究结果阐明了LytB在肺炎球菌细胞壁重构和细菌粘附侵染过程中发挥功能的分子机制，为新型抗生素和疫苗的开发提供了理论基础。
　　Ⅱ.肺炎链球菌耐药相关蛋白Sp0010的结构和功能研究
　　肺炎链球菌能导致患者具有极高死亡率的原因是很多肺炎链球菌具有多重耐药性。革兰氏阴性菌和阳性菌常常利用β-内酰胺酶来抵抗β-内酰胺类抗生素，然而到目前为止肺炎链球菌中还没有β-内酰胺酶被鉴定出来。我们合作者提供的实验数据表明在肺炎链球菌TIGR4中将编码一个推测为β-内酰胺酶的基因Sp0010敲除后，肺炎链球菌对多种抗生素敏感。因此，我们表达和纯化了这个蛋白进行结晶研究，并收集了一套2.5(A)分辨率的野生型蛋白Sp0010数据。通过肽聚糖结合实验，我们证明了蛋白Sp0010能够结合肺炎链球菌的肽聚糖。通过生物化学与结构生物学方法研究蛋白Sp0010的结构与功能将最终揭示蛋白Sp0010介导肺炎链球菌抵抗多种抗生素的分子机理。

目录

声明

摘要

第一部分 肺炎链球菌肽聚糖水解酶LytB的结构和功能研究

第一章 LytB研究背景

1．1 引言

1．2 肽聚糖的再利用

1．3 肽聚糖糖链水解酶

第二章 LytB实验材料和方法

2．1 LytB实验材料

2．2 LytB实验方法

第三章 LytB实验结果

3．1 重组蛋白LytB与LytBCAT的表达、纯化

3．2 LytBCAT晶体的优化、衍射数据的收集、结构的解析与精修

3．3 LytBCAT的整体结构与关键活性残基

3．4 LytBCAT与可能的底物docking模型

3．5 SH3b与WW模块是LvtB发挥催化作用所必需的

3．6 LytB催化活性对于肺炎链球菌粘附和侵染人肺上皮细胞是必需的

第四章 LytB实验结果分析与讨论

4．1 含GH73模块细胞壁水解酶的结构功能关系

4．2 LytB和其同源蛋白具有类似的结构组成模式

4．3 LytB可以作为研发药物的候选靶标

小结

参考文献

第二部分 肺炎链球菌耐药相关蛋白Sp0010的结构和功能研究

第五章 Sp0010研究背景

5．1 细菌与抗生素

5．2 β-内酰胺酶与细菌耐药性

第六章 Sp0010实验方法、结果与分析

6．1 Sp0010实验方法

6．2 Sp0010结果与分析

小结

参考文献

第三部分 其他工作

第七章 结核分枝杆菌第二信使c-di-GMP合成和降解途径中重要酶的结构与功能研究

7．1 Rv1354c研究背景

7．2 Rv1354c和Rv1357c实验方法

7．3 蛋白Rv1354c和Rv1357c结果与分析

小结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议