丹参酮ⅡA对β-淀粉样蛋白诱导脑微血管内皮细胞损伤防护作用的机制研究

摘要

目的：本课题以脑微血管内皮细胞（ Brain Microvascular Endothelial Cells， BMEC）为研究对象，建立β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein， Aβ）诱导的脑微血管内皮细胞损伤模型，观察丹参酮ⅡA对血管细胞粘附分子-1（ Vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）和核转录因子（ Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）等相关因子的影响，初步探讨丹参酮ⅡA保护脑微血管内皮细胞防治阿尔茨海默病（ Alzheimer’s disease，AD）的作用及其可能机制，为丹参酮ⅡA用于 AD的临床治疗提供一定的实验依据。　　方法：　　1、实验分组：把 BMEC进行传代培养，用生长状态良好的 BMEC进行实验，实验分为5组，即正常组、模型组和低、中、高3个丹参酮ⅡA用药组。　　2、 MTT法检测细胞活性：选择状态生长良好的 BMEC，用 MTT法检测各组细胞的活性，选取细胞活性最佳的丹参酮ⅡA浓度组以及最佳的药物作用时间点。　　3、微板法检测各组细胞培养液中 LDH的含量：用微板法检测丹参酮ⅡA作用 BMEC24小时后，各组细胞培养液中 LDH的含量。　　4、 ELISA法检测各组细胞培养液中 VCAM-1的含量：用 ELISA法检测丹参酮ⅡA作用 BMEC24小时后，各组细胞培养液中 VCAM-1的含量。　　5、 Western Blot法检测各组细胞相关蛋白的表达水平：用 Western Blot法检测丹参酮ⅡA作用 BMEC24小时后，各组细胞相关蛋白 NF-κB、IKB-α和 VCAM-1等表达水平。　　结果：　　1、 MTT法检测细胞活性　　结果（ OD值）显示：与正常组比较，模型组细胞活性有下降趋势，差异有统计学意义（ P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA的3个浓度用药组细胞活性均有上升趋势，差异有统计学意义（ P<0.05），其中以30μg/mL浓度组差异显著（ P<0.01），10μg/mL、50μg/mL浓度组有差异（ P<0.05），以30μg/mL浓度组效果最佳；药物作用时间以24小时最佳。因此，本实验的后续实验采取丹参酮ⅡA10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL3个浓度进行，设为丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度的用药组，药物作用时间以24小时最佳。　　2、微板法检测各组细胞培养液中LDH活性　　结果显示：与正常组比较，模型组LDH分泌水平上调（P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组LDH的分泌水平均下调（P<0.05）。　　3、 ELISA法检测各组细胞培养液中VCAM-1的含量　　结果显示：与正常组比较，模型组VCAM-1分泌水平均上调（P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组VCAM-1的分泌水平均下调（P<0.05）；且中浓度用药组VCAM-1下调水平较多（P<0.01），效果明显优于低浓度和高浓度用药组。　　4、 Western Blot法检测各组细胞相关蛋白的表达水平　　结果显示：①VCAM-1蛋白表达水平：与正常组比较，模型组VCAM-1蛋白表达水平上调（P<0.05）；与模型组相比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组VCAM-1的表达水平均下调（P<0.05）；且中浓度用药组VCAM-1下调水平较多（P<0.01），效果明显优于低浓度和高浓度组用药。②IKB-α蛋白表达水平：与正常组比较，模型组 IKB-α表达水平下调（P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组IKB-α的表达水平升高（P<0.05）；且中浓度用药组IKB-α上调水平较多（P<0.01），效果明显优于低浓度和高浓度用药组。③NF-κB p65蛋白表达水平：与正常组比较，模型组 NF-κB p65分泌水平上调（P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组NF-κB p65的分泌水平均下调（P<0.05）；且中浓度用药组NF-κB p65下调水平较多（P<0.01），效果明显优于低浓度和高浓度用药组。④ NF-κB p65蛋白磷酸化表达水平：与正常组比较，模型组NF-κB p65蛋白磷酸化分泌水平上调（P<0.05）；与模型组比较，丹参酮ⅡA低、中、高3个浓度用药组NF-κB p65蛋白磷酸化的分泌水平均下调（P<0.05）。　　结论：　　1、丹参酮ⅡA能够改善 BMEC损伤后的细胞活性，减少炎症因子的表达，有助于防治阿尔茨海默病。　　2、丹参酮ⅡA能够降低 Aβ1-42致 BMEC炎症因子的表达，防治阿尔茨海默病，抑制 NF-κB通路可能是其作用机制之一。

目录

声明

缩略语表

前言

材料与方法

1 材料与仪器

2 方法与步骤

3 统计学处理

结果

1 BMEC 细胞形态学观察

2 TanⅡA 对于 BMEC 细胞活力的影响

3 微板法检测各组细胞培养液中 LDH 活性

4 ELISA 法检测各组细胞 VCAM-1 的含量

5 Western Blot 法检测各组细胞相关蛋白表达水平

讨论

1 中医药对 AD 的认识与探讨

2 现代医学对 AD 的认识与探讨

展望

结论

致谢

参考文献

附录

附录 1

附录 2综述：中医药防治阿尔茨海默病的机制研究进展

附录 3